Box-Behnken 响应面法优化夏枯草中科罗索酸和山楂酸提取工艺

黄宽，向润清，张艳娇，付鹏，李江，范源，2

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，有清肝火、明目、消肿、散结等功效[1]。夏枯草主要化学成分为三萜类、甾醇类、黄酮类、香豆素类、有机酸和糖类等成分[2]，而以熊果酸为主的三萜类化合物是重要的活性成分，熊果酸的衍生物科罗索酸和山楂酸是一对五环三萜类同分异构体化合物（见图1），属乌苏烷型五环三萜类化合物，具有调节免疫[3]、抗氧化[4-6]、抗炎[7-8]、抗菌[9]、抗过敏[10]、抗肿瘤[11]和降低胆固醇[12]作用，基本骨架为多氢蒎的五环母核，多采用HPLC 进行定量分析[13-17]。科罗索酸和山楂酸为同分异构体，结构和化学性质相似，出峰时间接近，分离测定存在一定难度。目前夏枯草中科罗索酸和山楂酸提取工艺相关报道较少。本研究建立夏枯草中科罗索酸和山楂酸HPLLC 定量分析方法，优化其提取工艺，为夏枯草的开发利用提供依据。

取同一批样品6 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果科罗索酸、山楂酸含量RSD 分别为1.57%、0.64%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品（每1 g 夏枯草中含科罗索酸0.487 5 mg、山楂酸0.275 0 mg）粉末6份，每份精密称取1 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，加入科罗索酸和山楂酸对照品适量（约相当于1.0 g 样品中所含科罗索酸和山楂酸的量），再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表1。

表1 夏枯草中科罗索酸和山楂酸加样回收率试验

2.2 单因素试验

采用加热回流法提取夏枯草中的科罗索酸和山楂酸，将料液比、加热回流时间、回流次数及乙醇浓度作为影响因素，固定其中3 个因素，以提取率为评价指标，对另一因素进行单因素试验。固定提取时间为60 min、提取次数为1 次、料液比为1∶10 g/mL，考察乙醇体积分数（75%、80%、85%、90%）对提取率的影响，优选最佳乙醇体积分数。按优选条件依次考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）、提取时间（60、80、100、120 min）、提取次数（1、2、3 次）对提取效果的影响。结果最佳条件为:乙醇体积分数80%，料液比1∶20（g/mL），提取时间120 min，提取次数2 次。见图2。

图2 夏枯草中科罗索酸和山楂酸提取工艺单因素试验结果

2.3 Box-Behnken 响应面法优化提取工艺

2.3.1 响应面试验设计及结果

依据Box-Behnken 响应面试验设计原理，结合单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表2，试验结果见表3。

表2 夏枯草中科罗索酸和山楂酸提取工艺因素水平表

2.3.2 模型拟合与方差分析采用Design-expert8.0.6 软件对试验结果进行分析，得回归方程Y＝815.38＋6.72A＋5.17B＋13.33C＋7.78D－0.65AB＋5.65AC－1.27AD＋1.25BC－4.75BD－2.82CD－5.44A2－18.23B2－41.52C2－15.23D2，R2＝0.960 5。F＝24.30，P＜0.000 1，表明回归模型极显著；失拟项F＝0.53，P＝0.808 2，表明模型失拟项不显著，可用于分析试验数据。以Y 为响应值时，模型的一次项影响顺序为C＞D＞A＞B，一次项C 和二次项B2、C2、D2有极显著影响（P＜0.001），一次项A、D 有高度显著影响（P＜0.01），一次项B 有显著影响（P＜0.05），表明所得回归方程能较好地预测各影响因素对提取效果的影响。见表4。

2.3.3 响应面优化及预测

经Design-expert8.0.6 软件分析得到响应面图（见图3）。可以看出，提取次数对总含量影响较大，交互项对总含量无显著影响，忽略交互作用，以回归模型的极值分析得到最优提取条件为:乙醇体积分数88.47%，提取时间102.22 min，提取次数2.20 次，料液比1∶20.95（g/mL），科罗索酸和山楂酸总含量预测值为820.09 μg。综合实际情况考虑，调整最优提取条件为:乙醇体积分数88.5%，提取时间100 min，提取次数2 次，料液比1∶20（g/mL）。

本研究预试验分别对不同提取溶剂（甲醇、乙醇）和不同提取方式（超声提取、加热回流提取、浸渍提取）进行了考察，结果表明，乙醇加热回流提取对科罗索酸和山楂酸的提取效果最好。此条件下所得目标产物含量最高，色谱峰杂峰少，操作简便。同时以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸溶液作为流动相进行考察，结果表明甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相时色谱图峰形好，分离效果好且基线平稳。对提取液中科罗索酸和山楂酸的含量测定进行方法学考察结果表明，其专属性、线性关系、系统适用性试验均符合分析要求，仪器精密度、稳定性、重复性、精确度RSD 均小于2.0%。

本试验采用响应面设计试验得到科罗索酸和山楂酸加热回流提取的最佳工艺:乙醇体积分数88%，料液比1∶20，提取时间100 min，提取2 次。验证试验结果表明，最佳提取工艺所得科罗索酸和山楂酸总含量为817.8 μg，拟合模型能较为准确地预测提取效果，说明采用响应面分析法优化提取工艺合理可行。