化聚消积方对肥胖伴高血压大鼠早期肾损伤的影响

何燕铭，张曾，蒋琳，文世梅，邵燕婷，王文健

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.复旦大学附属华山医院，上海 200040；3.上海市中医药研究院中西医结合临床研究所，上海 200437

肥胖与高血压作为代谢异常的代表性疾病，都是导致肾脏损伤的独立危险因素[1-2]。随着生活水平的提高和生活方式的改变，临床往往出现肥胖合并高血压患者，这些患者因合并胰岛素抵抗、肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）亢进等病理因素而引起微血管病变及后继肾脏损伤可能性明显增加。因此，改善肥胖伴高血压导致的肾脏损伤具有重要的临床意义。目前临床较多使用血管紧张素受体抑制剂类药物治疗[3-4]，可降低尿微量白蛋白（microalbuminuria，MAU），但不能完全改善肾脏疾病进展，仍存在相当的残余风险。前期临床及基础研究发现，益气散聚方可有效增加肥胖患者胰岛素敏感性[5]，在此基础上优化中药复方化聚消积方可有效降低糖尿病肾病患者MAU[6]。因此，本研究观察化聚消积方对肥胖伴高血压早期肾损伤的影响，探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量180～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2008-0016。饲养于温度18～25 ℃、相对湿度50%～80%环境，自由摄食饮水。

1.2 药物

化聚消积方（黄芪30 g，黄连10 g，蒲黄15 g，泽泻15 g，绿豆衣30 g，六月雪15 g，附子9 g，积雪草15 g），饮片购自上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房:常规加水煎煮、过滤，提取液合并，减压浓缩至比重约为1.2（60 ℃），浓缩液静置放冷，加乙醇至70%乙醇浓度，静置过夜，吸取上清液，减压回收乙醇，真空干燥，粉碎，得浸膏粉。浸膏粉制作由国家中药制药工程技术研究中心完成，4 ℃保存，双蒸水稀释至所需浓度使用。缬沙坦胶囊，北京诺华制药有限公司，规格80 mg/粒，批号X0320。灌胃前用双蒸水配成相应浓度溶液。

1.3 主要试剂与仪器

MAU ELISA 试剂盒（MyBioSource，批号MBS2022813 ）， SYBR Green supermix （ Takara Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China，批号DRR041A），血管紧张素Ⅱ 1 型受体（AT1R）一抗（ab124734，Abcam）、AT2R 一抗（ab92445，Abcam），二抗（马抗兔ab6721，Abcam），DAB 染色试剂盒（碧云天公司，批号 P0203）。国产智能无创血压计（Softron，型号BP-98A），酶标仪（BioTek，型号Epoch），水浴锅（Leica，型号HI1210），超低温冰箱（Revco，型号ULT2586-4-V），实时定量PCR 仪（Roche，型号LightCycler 480Ⅱ），石蜡切片机（Leica，型号RM2235），正置显微镜（Leica，型号DM2000）。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

SD 大鼠适应性饲养10 d，随机分为正常组10 只和高盐高脂组30 只，正常组给予正常饮食喂养，高盐高脂组给予高盐高脂喂养（18%猪油、8%蛋黄粉、2%胆固醇、0.2%胆盐、4%食盐和67.8%普通饲料）。2 周后高盐高脂组随机分为模型组、阳性药组及中药组，每组10 只。给药剂量按体表面积换算成临床成人用药量的6 倍，阳性药组予缬沙坦药液13.3 mg/kg灌胃，中药组给予化聚消积方药液8.13 g/kg 灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。每日1 次，给药体积为2 mL，连续6 周，整体实验共8 周。实验过程中，正常组大鼠予普通饲料，其余各组大鼠均予高盐高脂饲料。

2.2 标本收集及处理

实验8 周后，代谢笼收集24 h 尿液。次日隔夜空腹12 h，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，2500 r/min离心15 min，分离血清、血浆，置-20 ℃冰箱保存，取肾脏组织-80 ℃冰箱冻存，石蜡包埋，切片。

2.3 指标检测

2.3.1 体质量、血压及生化检测套尾法检测大鼠血压，每2 周检测1 次，平均动脉压（MAP）计算方法为舒张压＋1/3 脉压差。处死前常规检测大鼠体质量。ELISA 检测大鼠MAU 水平，按照试剂盒说明书进行操作，酶标仪读取OD 值。收集大鼠动脉血，离心，获取大鼠血清及血浆，置于-20 ℃冰箱保存。生化法检测血清肌酐（Cr），放免法检测血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、血管紧张素转换酶（ACE）的水平。

2.3.2 肾脏组织常规染色及免疫组化检测

和能量代谢，导致肥胖、高血压等疾病，是典型的脾虚不化状态。聚证不治，又可引起许多继发病变，病久伤及脉道，络瘀脉损，血运蹇涩，肾络瘀阻，邪浊留积，壅塞三焦，开阖不利，则出现腰痛、水肿、关格等。这些病证则属聚证不治而致的“积证”范畴，相当于在肥胖高血压患者中常见的肾功能异常以致衰竭。因此，治疗要宜及早，要在“化聚”基础上“消积”[9-10]。治以攻补兼施、温肾散积，治疗“积证”，据此，王文健教授创立益气化聚方，方中黄芪甘温补中，推动气化，助脾散聚布精，为君药；黄连苦寒，清热、泻火、燥湿，祛湿热之邪，为臣药；泽泻甘寒，利水、渗湿、泄热，助黄连清热，热随湿去，邪去则清气得生，浊气得降，为佐药；蒲黄味甘性微寒，血分药而兼行气分，上者可清，下者可利，滞者可行，为使药。诸药合用，既推动气化之功能，又消散滞留之病邪，使精微物质能够正常布散运化。在此基础上加温肾清利消积中药组成化聚消积方，治疗代谢紊乱导致的肾脏慢性病变。

本研究结果显示，化聚消积方可有效改善肥胖伴高血压大鼠MAU，肾脏Renin、AngⅡ及AT1R 表达明显降低，肾小管局部AT1R 及AT2R 蛋白表达明显抑制。血液中检测的循环RAS 相关指标在各组间未见明显异常，说明循环RAS 并未明显激活。AngⅡ是一种活性很高的升压物质，可通过血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞、心、脑、肾等器官的细胞上血管紧张素受体产生作用[11-13]。经8 周高盐高脂饮食干预，模型组大鼠肾脏RAS 显著激活，表现为肾脏AngⅡ、ACE、AT1R mRNA 表达显著升高。而经6 周药物治疗，阳性药组与中药组均显著抑制肾脏RAS 的激活状态，说明中药治疗对肥胖伴高血压大鼠肾脏RAS有良好的调节作用。

肾小管局部RAS 在高血压发生发展中的作用举足轻重，越来越受到研究者重视[14]。AngⅡ通过AT1R及AT2R 直接作用在肾小管，能影响肾小管特别是远曲小管在各种物质重吸收的作用，进而影响机体血压变化，并进一步影响各种靶器官的功能。但目前该途径机理及干预的相关研究较少。本研究发现，模型组肾小管AT1R 及AT2R 表达均明显升高，说明RAS在肾小管局部的作用明显增强。经药物干预后，各给药组AT1R 及AT2R 表达均明显降低，且明显降低肾小管RAS 激活水平，这可能也是其有效降压的机理之一，更深入的机制有待进一步研究。