miRNA-30家族在骨肉瘤中的表达及其临床意义△

成世高，王万春，蒋栋，李腾飞，李洵，任炼，肖炯哲，康鹏程

1中南大学湘雅二医院骨科，长沙 410011

2娄底市中心医院骨科，湖南 娄底 417000

骨肉瘤是一种罕见的恶性间叶细胞肿瘤，具有 高度侵犯性和转移性，即使利用手术切除结合化学治疗，对已有转移的病患治疗后的效果并不理想[1]，目前，对于骨肉瘤的发生和转移的机制仍未研究清楚[2]。因此，识别和验证有效的肿瘤特异性标志物用于骨肉瘤早期诊断对提高临床疗效，制订个性化治疗方案有重要临床意义。

研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）是影响骨肉瘤发展的重要因子，相关miRNA表达情况能够在一定程度上决定骨肉瘤患者的疾病发展[3]。miRNA是一段长约22～24个核苷酸的单链RNA。有学者预测，人类超过30%的基因受到miRNA调控[4-5]。当细胞的生长失去控制或不再具有细胞凋亡的功能时，通常会导致肿瘤的发生。因此，近年来关于miRNA与肿瘤的研究中，重点多在于miRNA对细胞生长和细胞凋亡的调控。miRNA-30家族由5种高度同源的成员组成，即miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d 和 miRNA-30e，miRNA-30家族成员在多种肿瘤细胞增殖、分化、迁移和侵袭中发挥重要作用[6-7]。miRNA-30家族成员在不同肿瘤中的作用各不相同，甚至相互冲突，其在肿瘤起始和进展中既发挥抑癌基因又发挥原癌基因的作用。miRNA-30在乳腺癌[6]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮肤鳞状细胞癌[12]中发挥抑癌基因的作用。多项研究发现，miRNA-30家族成员在乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、肝癌[15]等多种肿瘤中发挥原癌基因作用。miRNA-30家族在不同实体瘤中的作用不同甚至相反，表明miRNA-30在肿瘤发生发展中有多种不同作用，但其机制仍需进一步深入研究。目前，关于miRNA-30家族在骨肉瘤中表达意义的研究较为少见，本研究首先采用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）检测5种miRNA-30家族成员在骨肉瘤及相应正常成骨组织中的表达情况，并进一步采用原位杂交实验检测荧光实时定量RT-PCR筛选的在骨肉瘤和正常成骨组织中表达有差异的miRNA-30家族成员的表达情况，分析这些miRNA与骨肉瘤患者临床特征的关系，旨在为骨肉瘤的诊治提供新的靶点和思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2017年12月中南大学湘雅二医院收治的骨肉瘤患者。纳入标准：均经外科手术后标本送检由临床病理科诊断确诊。依据纳入标准，本研究共纳入36例骨肉瘤患者，男21例，女15例，年龄6～34岁，平均年龄为（17.2±3.4）岁；失访4例，随访资料完整32例，随访时间5～50个月，平均随访时间（47.1±3.4）个月；Enneking外科分期：ⅡA期5例，ⅡB期27例；肿瘤部位：股骨9例，胫腓骨14例，其他部位（包括肱骨、颌骨等）9例；分化程度：中高分化17例，低分化15例；肺转移12例，复发11例。取32例骨肉瘤组织和32例正常骨组织标本。

1.2 实验方法

1.2.1RT-PCR法检测miRNA-30家族成员的相对表达量 根据试剂盒说明书，提取骨肉瘤组织的总RNA。实时荧光定量RT-PCR法检测miRNA-30家族成员 miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d和miRNA-30e在骨肉瘤组织中的相对表达量。以U6为内参，设计miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c和miRNA-30d和miRNA-30e的引物（表1），引物设计完成后，BLAST分析引物序列合理性，最后送至深圳华大基因合成。以cDNA为模板，采用鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶逆转录为mRNA，计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.2 原位杂交实验检测miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表达情况 组织芯片脱蜡，于37℃蛋白酶消化15 min，漂洗后梯度乙醇脱水。55℃预杂交30 min后，地高辛标记的miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e探针（100 nmol/L）恒温杂交1 h，碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体室温孵育1 h，NBT/BCIP黑暗处30℃显色，核固红复染。杂交过程选择U6探针（1 nmol/L）作为阳性对照，去除探针作为阴性对照。结果判定：miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e主要定位于细胞质和细胞核，U6主要定位于细胞核，依据染色强度和阳性细胞所占比例评分：依据染色强度评分，无表达或弱表达计为0分，中等强度或强表达计为1分；根据阳性细胞所占比例，阳性细胞所占比例＜10%计为0分；阳性细胞所占比例≥10%计为1分；将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，0分表示表达阴性，1分表示表达阳性。所有的操作流程及相关的试剂均根据相关的说明书进行，请两名副高职称的病理医师进行盲阅。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；miRNA-30家族成员表达与骨肉瘤患者临床特征的关系采用χ2检验分析；骨肉瘤患者预后的影响因素采用Cox回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-30家族成员相对表达量的比较

骨肉瘤组织中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相对表达量均明显低于正常骨组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。而骨肉瘤组织中miRNA-30b和miRNA-30d的相对表达量与正常骨组织比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表 2）

表2 骨肉瘤患者骨肉瘤组织和正常骨组织中miRNA-30家族成员相对表达量的比较

2.2 骨肉瘤组织中miRNA-30家族成员阳性表达率的比较

原位杂交实验检测结果显示，miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e三种探针在骨肉瘤组织中均显示为蓝色的阴性颗粒；而在正常成骨组织中，显示为棕色颗粒或者团块（图1）。骨肉瘤组织中 miRNA-30a、miRNA-30c和 miRNA-30e的阳性表达率均明显低于正常骨组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表3）。

图1 原位杂交检测骨肉瘤患者骨肉瘤组织和正常骨组织中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表达情况（1%甲基绿染色，×200）

表3 骨肉瘤患者骨肉瘤组织和正常骨组织中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e阳性表达情况的比较[n（%）]

2.3 不同临床特征骨肉瘤患者骨肉瘤组织miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e阳性表达情况

不同性别、肿瘤部位和分化程度骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30a阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同Enneking外科分期、肺转移情况和复发情况骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30a阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=26.182、19.269、28.303，P＜0.05）。不同性别、肿瘤部位、分化程度、肺转移情况和复发情况骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30c阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同Enneking外科分期骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30c阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=17.293，P＜0.05）。不同性别、肿瘤部位、分化程度、Enneking外科分期和复发情况骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30e阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同肺转移情况骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30e阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=2.172，P＜0.05）。（表4）

表4 不同临床特征骨肉瘤患者骨肉瘤组织miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e阳性表达情况（n=32）

2.4 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表达情况骨肉瘤患者生存情况的比较

miRNA-30a、miRNA-30c阳性表达骨肉瘤患者平均生存时间均长于miRNA-30a、miRNA-30c阴性表达骨肉瘤患者，差异均有统计学意义（t=5.82、3.87、P＜0.05）；miRNA-30e阳性表达与阴性表达骨肉瘤患者平均生存时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表5）

2.5 骨肉瘤患者预后影响因素的单因素分析

不同miRNA-30e表达情况骨肉瘤患者3年生存率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同miRNA-30a表达情况、miRNA-30c表达情况、Enneking外科分期、肺转移情况和复发情况骨肉瘤患者3年生存率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表 6）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表达情况骨肉瘤患者的生存情况（月，±s）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表达情况骨肉瘤患者的生存情况（月，±s）

指标m i R N A-3 0 a表达阳性（n=5）阴性（n=2 7）m i R N A-3 0 c表达阳性（n=7）阴性（n=2 5）m i R N A-3 0 e表达阳性（n=8）阴性（n=2 4）4 1.3±4.2 2 8.2±1.6 3 9.7±5.1 2 4.9±2.2 2 9.7±1.8 3 5.1±3.5生存时间

表6 骨肉瘤患者预后影响因素的单因素分析（n=32）

2.6 骨肉瘤患者预后影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的miRNA-30a表达情况、miRNA-30c表达情况、Enneking外科分期、肺转移情况和复发情况作为自变量，骨肉瘤患者生存情况作为因变量纳入Cox分析，结果显示，miRNA-30a阴性表达和发生肺转移是骨肉瘤患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表7）

表7 骨肉瘤患者预后影响因素的多因素Cox分析（n=32）

3 讨论

目前，多项研究探讨了miRNA家族在骨肉瘤表达中的意义。Hong等[16]分析了血清miRNA-29家族成员表达水平在骨肉瘤筛查中的作用，结果表明，miRNA-29家族能够作为高级别骨肉瘤筛查的标志物，但作为低级别骨肉瘤筛查的灵敏度和特异度不足。miRNA-30家族以不同方式参与多种肿瘤的发生发展过程，可通过下调防止肿瘤发生的蛋白的表达发挥致癌因子的作用，又可作为抑癌因子抑制原癌基因蛋白的表达。miRNA-30a在滑膜肉瘤和视网膜母细胞瘤中表达上调，而在非小细胞肺癌和骨肉瘤中表达下调。miRNA-30a在卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮肤鳞状细胞癌[12]等肿瘤组织中表达下调。本研究结果显示，骨肉瘤患者骨肉瘤组织中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相对表达量明显低于正常骨组织。张汝益等[17]研究发现，骨肉瘤143B细胞株中miRNA-30a呈明显低表达，并进一步研究发现，过表达的miRNA-30a可能抑制人骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和活力，并部分通过抑制Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）的翻译发挥作用，与本研究结果一致。此外，信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是重要的转录因子，其表达通常在恶性肿瘤细胞中呈上调状态。STAT3的主要作用是通过STAT3/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路引起炎性微环境的改变，其主要负责炎症诱发肿瘤和抗肿瘤反应[17]。Chen等[18]通过研究胶质瘤发现，miRNA-30的表达水平与STAT3呈负相关，且STAT3可以激活正常细胞中miRNA-30b的表达并上调miRNA-30b的表达从而对STAT3的表达发挥负反馈的调节作用。这意味着miRNA-30可能通过下调STAT3的表达抑制肿瘤细胞的浸润。

本研究首先采用荧光实时定量RT-PCR检测了miRNA-30家族5种成员在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达情况，结果表明，骨肉瘤患者骨肉瘤组织中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相对表达量明显低于正常骨组织，提示这3种miRNA-30家族成员可能在骨肉瘤中发挥抑癌基因作用。这一研究结果，与既往关于miRNA-30家族在其他肿瘤中的研究结果一致。

目前，荧光实时定量RT-PCR技术是检测miRNA表达的常规方法，能够检测组织中极其微量的miRNA，但荧光实时定量RT-PCR技术不能对miRNA在组织和细胞中的表达进行定位分析。因此，本研究进一步采用原位杂交技术检测这3种miRNA-30家族成员在骨肉瘤及正常骨组织中的表达情况，结果一方面与荧光实时定量RT-PCR技术结果一致，即这3种miRNA在骨肉瘤组织中低表达。

综上所述，本研究结果显示，miRNA-30a表达情况可能与骨肉瘤患者的性别、肿瘤部位及分化程度无关，与Enneking外科分期、复发情况及肺转移情况有关；miRNA-30c表达情况可能与骨肉瘤患者的Enneking外科分期有关；miRNA-30e表达情况可能与骨肉瘤患者肺转移情况有关。最后本研究采用单因素和多因素Logstic回归分析探讨影响骨肉瘤患者预后的危险因素，结果表明，miRNA-30a阴性表达和发生肺转移情况是骨肉瘤患者预后的独立危险因素。本研究结果显示，miRNA-30a能够抑制骨肉瘤发展，是预测骨肉瘤患者生存的潜在有效生物标志物和有效治疗靶点。