干扰素诱导跨膜蛋白3过表达对胆囊癌细胞MHCC97增殖、迁移、侵袭的影响△

何小伟，陈雪菊，石世代，刘勇帆

吉安市中心人民医院普外科，江西 吉安 343000

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，在不同国家、地区、种族中的发病率均有所不同。胆囊癌起病隐匿，早期症状不明显，导致患者一经确诊，常处于晚期，预后极差[1-4]。因此探讨胆囊癌的发病机制对于胆囊癌的治疗具有重要意义。干扰素诱导跨膜蛋白3（interferon induced transmembrane protein 3，IFITM3）基因是IFITM家族的一员，位于人染色体11p5.5，碱基长度约为1.5 kb，编码蛋白分子量约为14 kD，由133个氨基酸组成。IFITM3基因的5'启动子区域/增强子区域含有干扰素刺激反应原件，会被干扰素所诱导继而编码跨膜蛋白，参与病毒感染、原始生殖细胞迁移、内胚层定位等[5-7]。近些年来研究还发现IFITM3在多种肿瘤组织中异常表达，如在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤中均过表达，并与肿瘤的发生发展密切相关[5,8-10]。但IFITM3在胆囊癌中的作用尚未见报道，因此本研究将构建IFITM3过表达载体，探讨IFITM3过表达对胆囊癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭的影响及相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人胆囊癌细胞MHCC97H购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

pCDNA3.1（+）、质粒小提试剂盒均购自北京天根生物科技有限公司；Trizon Reagent、Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；OPTI-MEM®Ⅰ购自美国Gbico公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；LipofectamineTM3000脂质体购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司。MF53倒置显微镜购自广州市明美光电有限公司；RT-6000酶标分析仪购自美国Rayto公司；UV-1600PC紫外可见分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司；CFX ConnectTM实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.3 IFITM3过表达载体的建立

查找IFITM3基因序列，引入酶切位点（XbaⅠ/XhoⅠ）生物合成基因片段[克隆至pcDNA3.1（+）载体上]。质粒转化DH5α，小提质粒，37℃，酶切2 h，1%琼脂糖凝胶电泳分离条带，将IFITM3-pcDNA3.1菌种以1∶100的比例接种于50 ml LB肉汤液体培养基（含有100 μg/ml氨苄西林）中，过夜培养，大提质粒并酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 实时荧光定量PCR检测IFITM3、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2associated X protein，BAX）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）mRNA 的表达

收集细胞，根据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测总RNA纯度[光密度值（optical density，OD）260/OD280=1.6～1.8，说明RNA纯度良好]，将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，70℃10 min，再迅速冰浴2 min，50℃15 min，85℃5 min，最后实时荧光定量PCR扩增，操作体系：RNase Free ddH2O 9.5 μl，模板 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，2×ULtra-SYBR Mixture 12.5 μl。反应程序：预变性 95 ℃10 min，变性 95 ℃ 10 s，退火 57.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环 30 次。扩增结果采用 2-ΔΔCt法进行分析，△△Ct=△Ct实验-△Ct对照，△Ct实验=Ct目的-Ct内参，△Ct对照=Ct目的-Ct内参。目的基因引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

1.5 质粒的转染

125 μl opti-MEM+5 μl LipofectamineTM3000 混匀，将125 μl opti-MEM+≥2.5 μgIFITM3-pcDNA3.1质粒（过表达组）或pcDNA3.1空白质粒（过表达对照组）+5 μl LipofectamineTM3000混匀，将两种混合物混匀，加入到6孔板中，此时胆囊癌细胞MHCC97H生长融合度达到70%，转染6 h，弃掉转染液，换上新鲜培养基，继续培养48 h，利用实时荧光定量PCR法检测转染效果。同时设立不转染任何质粒的空白对照为正常对照组。

1.6 CCK-8法检测细胞活力

将胆囊癌细胞MHCC97H接种到96孔板，当细胞融合度达到70%的时候，按1.5方法进行转染12、24、48、72 h，加入CCK-8试剂孵育4 h，于酶标仪波长560 nm处测OD值，OD值即代表细胞活力。

1.7 划痕实验法检测细胞迁移能力

将胆囊癌细胞MHCC97H接种到24孔板，当细胞融合度达到70%的时候，用10 μl的枪头在每个孔进行划线，线与培养板底部细线垂直，弃去培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次，加入新鲜培养基，后立即给每个孔的划痕拍照，记为0 h，接着按1.5方法进行转染，培养24 h后，再次给每个孔的划痕拍照，记为24 h，最后按照0 h与24 h相对应的划痕宽度，计算细胞的迁移速率。

1.8 Transwell法检测细胞侵袭能力

将Matrigel胶平铺于Transwell小室上，备用。将胆囊癌细胞MHCC97H单细胞悬液接种到Transwell上室，并按照1.5方法进行转染，培养48 h，而下室不接种细胞，仅加入新鲜培养基。转染结束后，将小室取出，多聚甲醛固定下室细胞10 min，结晶紫染色10 min，最后在倒置显微镜下观察并计数。

1.9 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒IFITM3-pcDNA3.1酶切后的电泳图谱

质粒IFITM3-pcDNA3.1经XhoⅠ/XbaⅠ酶切后，理论上应有1254 bp和5428 bp的条带，电泳检测结果与理论值都相符，证明IFITM3-pcDNA3.1为正确质粒。（图1）

图1 质粒IFITM3-pcDNA3.1酶切后的电泳图谱

2.2 质粒IFITM3-pcDNA3.1转染效果

IFITM3-pcDNA3.1质粒转染MHCC97H细胞48 h后，经实时荧光定量PCR法检测后，结果显示，与正常对照组（1.000±0.000）及过表达对照组（0.989±0.065）比较，过表达组（4.385±0.553）IFITM3mRNA表达量明显上调（F=222.471，P＜0.01）。

2.3 IFITM3过表达对MHCC97 细胞活力的影响

IFITM3-pcDNA3.1质粒转染MHCC97H细胞12、24、48、72 h后，CCK-8实验结果显示，转染12、24、48、72 h时，过表达组细胞OD值分别明显高于正常对照组及过表达对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；各组细胞在转染48、72 h时活力相当。（表2）

2.4 IFITM3过表达对MHCC97 细胞迁移及侵袭能力的影响

IFITM3-pcDNA3.1质粒转染MHCC97H细胞24 h后，划痕实验结果显示，过表达组细胞迁移速率明显高于正常对照组及过表达对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。IFITM3-pcDNA3.1质粒转染MHCC97H细胞48 h后，Transwell实验结果显示，过表达组细胞侵袭数目明显多于正常对照组及过表达对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（图2、图3、表3）

2.5 IFITM3过表达对MHCC97细胞中BAX、Bcl-2 mRNA 表达水平的影响

图2 划痕实验检测3组MHCC97H 细胞的迁移能力（×200）

图3 Transwell实验检测3组MHCC97H 细胞的侵袭能力（结晶紫染色，×200）

IFITM3-pcDNA3.1质粒转染MHCC97H细胞48 h后，PCR实验结果显示，过表达组中BAXmRNA表达水平明显低于正常对照组及过表达对照组，Bcl-2mRNA表达水平明显高于正常对照组及过表达对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表4）

3 讨论

IFITM3最初是于1984年在神经母细胞瘤干扰素治疗的cDNA文库筛选中获得的，除了能够表达于细胞膜上，还能够以颗粒样的形式存在于细胞质中。IFITM3基因位于人染色体11p5.5，碱基长度约为1.5 kb，编码蛋白分子量约为14 kD，由133个氨基酸组成。IFITM3基因的5'启动子区域/增强子区域含有干扰素刺激反应原件，会被干扰素所诱导继而编码跨膜蛋白，因此IFITM3在不同的细胞中发挥着不同作用，不仅能够调节免疫细胞活性，还能够参与生殖细胞的成熟与归巢，另外IFITM3还与IFITM1、IFITM2起协同作用，共同参与流感病毒、登革热等多种病毒的感染[5-8]。近些年来研究还发现IFITM3在多种肿瘤组织中异常表达，如IFITM3在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤中均过表达，并与肿瘤的发生发展密切相关[8-10]。Hu等[11]研究通过实时荧光定量PCR证实IFITM3在胃癌组织及胃癌细胞株中的表达水平均显著高于正常对照，同时IFITM3的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移密切相关。敲除IFITM3能显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，而且能够使细胞周期阻滞于G0/G1期，此过程与WNT/β-catenin信号通路有关。Zhang等[12]研究显示IFITM3表达于人肺腺癌组织的细胞质中，并与肿瘤恶性程度密切相关，敲除IFITM3能显著抑制肺腺癌细胞的增殖与侵袭。Yang等[13]研究结果显示，IFITM3shRNA能显著下调乳腺癌细胞中IFITM3表达，降低细胞活力，抑制细胞生长与克隆，并使细胞周期阻滞于G0/G1期。以上研究说明IFITM3的表达与胃癌细胞、肺腺癌细胞及乳腺癌细胞的增殖、侵袭等生物学行为密切相关，因此本研究构建IFITM3过表达载体，探讨IFITM3过表达对胆囊癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭的影响及相关机制。

表2 不同时间点MHCC97H细胞OD值的比较（±s）

表2 不同时间点MHCC97H细胞OD值的比较（±s）

注：a与正常对照组比较，P＜0.01；b与过表达对照组比较，P＜0.01

组别正常对照组过表达对照组过表达组F值P值0 h 0.336±0.042 0.336±0.025 0.336±0.070 0.000＞0.05 12 h 0.429±0.044 0.419±0.032 0.434±0.045a b 15.591＜0.01 24 h 0.574±0.033 0.563±0.054 0.720±0.056a b 19.141＜0.01 48 h 1.133±0.051 1.173±0.088 1.395±0.059a b 25.905＜0.01 72 h 1.142±0.118 1.158±0.057 1.389±0.034a b 79.384＜0.01

表3 3组MHCC97H细胞迁移速率及侵袭数目的比较（±s）

表3 3组MHCC97H细胞迁移速率及侵袭数目的比较（±s）

注：a与正常对照组比较，P＜0.01；b与过表达对照组比较，P＜0.01

组别正常对照组过表达对照组过表达组F值P值8.8 0±0.8 0 9.2 6±0.8 0 1 3.4 3±1.6 0 a b 3 0.4 9 8＜0.0 1 1 2 8±1 3 1 3 2±1 2 1 9 8±1 5 a b 5 1.7 0 3＜0.0 1迁移速率（μ m/h）侵袭数目

表4 3组MHCC97H细胞中BAX、Bcl-2 mRNA表达水平的比较（±s）

表4 3组MHCC97H细胞中BAX、Bcl-2 mRNA表达水平的比较（±s）

注：a与正常对照组比较，P＜0.01；b与过表达对照组比较，P＜0.01

组别正常对照组过表达对照组过表达组1.0 0 0±0.0 0 0 0.9 8 0±0.1 8 6 0.6 3 4±0.0 0 2 a b 1.0 0 0±0.0 0 0 1.0 2 7±0.0 7 5 2.0 0 9±0.0 4 1 a b F值P值B A X m R N A 2 2.0 2 9＜0.0 1 B c l-2 m R N A 8 1 7.5 9 2＜0.0 1

本研究首先构建了IFITM3-pcDNA3.1过表达载体，并通过酶切后电泳，证实所构建载体成功。接着将IFITM3过表达载体转染胆囊癌细胞MHCC97H，实时荧光定量PCR实验证实转染成功。本研究探讨IFITM3过表达对MHCC97H胆囊癌细胞活力的影响，CCK-8实验结果显示转染24、48、72 h时，MHCC97H细胞活力提高，其中48、72 h细胞活力相当。进一步划痕实验结果发现IFITM3过表达能显著加快MHCC97H细胞迁移速率，Transwell实验结果显示IFITM3过表达能显著增加MHCC97H细胞侵袭能力，从而说明过表达IFITM3能显著促进MHCC97H细胞增殖、迁移及侵袭。抑制凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白BAX是Bcl-2家族最为常见的凋亡蛋白，二者能够形成异源二聚体，传递凋亡信号，促进细胞凋亡，在多种肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[14-15]。所以本研究进一步探讨IFITM3过表达对MHCC97H胆囊癌细胞中Bcl-2、BAXmRNA表达的影响，结果证实IFITM3过表达能显著上调Bcl-2mRNA表达，下调BAXmRNA表达，进而调控细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为。

综上所述，本研究成功构建了IFITM3-pcDNA3.1过表达载体，并成功转染MHCC97H胆囊癌细胞，还证实了IFITM3过表达能显著促进MHCC97H细胞增殖、迁移及侵袭，同时还能调控Bcl-2及BAX表达，说明IFITM3可能成为胆囊癌基因治疗的新靶点。