猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

畅通，刘飞

(上海海利生物技术股份有限公司，上海兽用生物制品工程技术研究中心，上海 201403)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)的成员。无囊膜，不具有血凝活性，是目前人类发现的最小的动物病毒[1]。PCV主要有两种血清型，即PCV1和PCV2。PCV1对猪的致病性较低，尚没有试验证明其具有感染性;PCV2对猪的危害性极大，可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)和母猪繁殖障碍等[2-3]。

自2010年开始一种有圆环病毒特征的新型病毒被陆续报道，但未确定其种属。直到2016年才将该病原体命名为猪圆环病毒3型(PCV3)[4-5]。同年3月，在我国辽宁、江西、重庆3个地区猪场共计356头母猪，先后发生繁殖障碍导致新生仔猪死胎率达到5.02%～20.1%，母猪死亡率达到5.4%～10.5%，利用RT-qPCR或qPCR对相关病原进行检测后，发现只有PCV3显示阳性[6]。2017年初，首次检出并公布PCV3在我国流行[6]。目前国内猪圆环病毒3型分为2个簇，即3a和3b。美国PCV3分离株PCV3-USA-MO2015(KX778720.1)属于3a簇群。为了检测PCV3 流行情况，国家兽用药品工程技术研究中心收集福建、河北、河南等8个省份发病猪场189份临床样品，阳性率达到12.7%；同时，该中心利用PCV3 ELISA抗体检测方法检测了江西、安徽、河南等14个省份908份血清样品，阳性率高达 48.02%[4-6]。由此可见，PCV3早已广泛流行于我国猪群中。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术具有精确度高、特异性强、重复性好、自动化程度高的优点[7-8]，目前已广泛应用于各种动物病原的快速检测。本试验拟建立PCV3的荧光定量PCR检测手段，以期为疫苗研发、生产检验及流行病学检测等提供一种快捷可靠的技术。

1 材料与方法

1.1 病料及阳性质粒来源

PCV3阳性猪血清采自湖北某猪场；PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪瘟病毒(CSFV)阳性质粒均由本实验室鉴定并保存。

1.2 主要试剂及仪器

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)和pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，steponeplus 实时荧光定量PCR仪和普通PCR仪为美国ABI公司产品。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上发布的PCV3的Cap基因的核苷酸序列(序列号：AYA44222.1)，通过MegAlign软件比对序列，选择一段相对保守序列的区域，利用Primer Premier 5.0软件进行分析，设计特异性qPCR引物和探针。上游引物序列为PCV3-Fq：GAGGCTTTGTCCTGGGTGAG，下游引物序列为PCV3-Rq:ATGCGGAAAGTTCCACTCGT，荧光探针序列为PCV3-CAP-Pq：CCGTTACTTCACCCCCAAACCAATTCT，预计扩增的目的片段长度为113 bp。引物探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 质粒标准品DNA模板的制备

按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒的操作说明书，提取PCV3阳性毒株的DNA，并以此DNA为模板，使用上述荧光定量PCR引物进行PCR扩增。50 μL扩增体系为：Premix Taq预混酶25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。采用1%浓度的琼脂凝胶电泳对PCR产物进行验证。

使用琼脂凝胶回收试剂盒对初步验证正确的PCR产物进行切胶、回收、纯化，然后与载体pMD18-T连接，转化至DH5α感受态细胞中，氨苄平板上挑取单菌落，过夜摇菌后提取重组质粒标准品。使用NANODROP 2000核酸蛋白仪对质粒质量浓度进行测定，结果为395 ng/ μL。将质粒标准品进行qPCR验证，同时送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.5 TaqMan荧光定量PCR反应条件的优化

为获得较为理想的Ct值，提高反应灵敏性，分别对退火温度、荧光探针与模板添加量的比例进行优化试验，筛选出Ct值最小时对应的最优退火温度、荧光探针与模板添加量的比例。退火温度分别为50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃，荧光探针与模板的比例分别为1∶1、1∶2、2∶1。每次试验均设立对照(no template control，NTC)。

1.6 标准曲线的建立及敏感性试验

采用1.5确定的最佳qPCR反应条件和反应体系，使用灭菌ddH2O将质粒标准品经10倍梯度稀释(10-1～10-8)后作为模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应完毕由系统自动绘制生成标准曲线。

1.7 特异性试验

以PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV阳性质粒为模板，通过建立的荧光定量PCR体系进行qPCR反应，同时设立NTC对照，以此来评价该方法的特异性。

1.8 重复性试验

1.9 临床样本的检测

取本实验室保存的湖北某猪场的72份猪血清，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取病毒基因组，采用上述已建立好的TaqMan荧光定量PCR方法和普通PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 标准品质粒构建

提取PCV3的DNA经设计的特异性引物PCR扩增后获得预期大小的片段。然后回收目的片段、连接、转化，挑取典型单菌落摇菌后提取重组质粒标准品。通过PCR、酶切及测序鉴定，构建的重组质粒标准品正确。PCR扩增出现645 bp的目标条带，阴性对照无特异性条带出现(见图1)。

M.DNA分子质量标准；1.增的PCV3目的片段；2.阴性对照图1 PCR 扩增

2.2 TaqMan荧光定量PCR反应条件的优化

经过一系列荧光定量PCR反应条件的优化(见表1)，得到最优反应体系为：Premix Ex Taq(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，荧光探针0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。最优反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min,40个循环。

表1 荧光定量PCR反应条件的优化结果

2.3 荧光定量 PCR 标准曲线的绘制

将质粒标准品做10倍梯度稀释后作为模板，采用上述优化的qPCR体系和程序进行PCR反应，得到不同浓度模板的扩增曲线(见图2)。以起始模板浓度的对数为横坐标，荧光Ct值为纵坐标绘制标准曲线(见图3)。如图3所示，样品初始模板的浓度(x)与Ct值(y)的线性关系式为：y=-3.266x+37.41，斜率为-3.266，截距为34.939，相关系数R2为1，扩增效率为102.371%。

图2 以不同浓度的标准质粒为模板制作的扩增曲线

图3 实时荧光定量PCR标准曲线

2.4 特异性试验

采用已建立好qPCR方法对PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV阳性质粒进行检测，结果显示，只有PCV3阳性质粒的检测结果为阳性，其他均为阴性(见图4)。将PCV3 qPCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，仅在113 bp处扩增出1条特异性条带，结果与预期大小相符(见图5)。

A.PCV3阳性质粒；B～G.分别为PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV的阳性质粒。图4 实时荧光定量PCR特异性的检测

M. DNA 分子质量标准；1.荧光特异性引物的扩增产物；2.阴性对照图5 荧光特异性引物的PCR检测

2.5 灵敏性试验

将PCV3 qPCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，仅在113 bp处扩增出一条特异性条带，结果与预期相符(见图5)。

将PCV3阳性样品10倍梯度稀释作为模板，同时采用上述已建好的qPCR方法和常规PCR方法对稀释好的模板进行灵敏性对比检测。结果显示，荧光定量PCR方法可检测到10-7对应的阳性模板(见图6)，而常规PCR方法只能检测到10-5对应的阳性模板(见图7)。

1～8.分别为10-1～10-9稀释的标准质粒； NTC.阴性对照图6 实时荧光定量PCR灵敏性试验结果

M. DNA 分子质量标准；1～8.分别为10-1～10-8稀释的标准质粒；9.阴性对照图7 常规PCR灵敏性试验结果

2.6 重复性试验

采用本研究建立的荧光定量PCR方法，分别作批内重复试验和批间重复试验，通过统计学方法计算变异系数，结果见图8、表2和表3。

图8 批内重复性试验

表2 实时荧光定量 PCR 的批内重复性试验

表3 实时荧光定量 PCR 的批间重复性试验

重复性试验显示，批内变异系数为0.01%～0.41%，批间变异系数为0.02%～0.47%，变异系数均小于2%，说明离散程度较小，本方法具有良好的重复性和稳定性。

2.7 临床样本的检测

应用本试验建立的PCV3荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采自湖北某猪场的72份血清样品进行检测。结果显示，该荧光定量PCR方法阳性检出率为16.7%，而常规PCR阳性检出率为12.4%，将常规PCR检测的阳性品经荧光定量PCR复检全部为阳性。说明该荧光定量PCR方法更为灵敏，可用于大批量样本的快速定量检测。

3 讨论

自2016年末PCV3被正式命名以来，虽然报道的文献很少，但是其检测阳性率居高不下，充分显示PCV3正在全国猪场中大规模流行，给养猪业造成巨大经济损失。研究和建立一种快速有效检测方法对于有效防控PCV3的传播，提高我国猪养殖业的健康发展具有重大意义。

目前圆环病毒的主要诊断方法有病毒分离鉴定、电镜检查、原位杂交、免疫组化和PCR等[9-11]。随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR已被广泛用于病原快速定量检测和基因分型等方面[12-13]。该方法全程在单管封闭环境下进行，微机控制，避免了假阳性或者假阴性的出现，具有极高的灵敏性，非常适合微量病原的快速检测[14]。

本研究以PCV3的ORF2基因保守区域设计特异性荧光引物和探针，建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。进一步优化反应程序和反应体系，提高了反应的特异性和灵敏性。通过构建质粒标准品，绘制标准曲线，可见在3.39×101～3.39×107copies/μL范围内，Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系，线性方程的相关系数R2达到1；特异性试验结果表明，PCV3与PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV均无交叉反应，具有良好的特异性；该qPCR方法的灵敏度达到10 copies/μL，比常规PCR灵敏100倍；通过对72份临床样本进行检测，建立的qPCR方法阳性检出率为16.7%，而常规PCR阳性检出率为12.4%，说明该qPCR方法具有较高的灵敏性；重复试验结果表明，批间和批内试验变异系数均小于2%，说明该方法具有良好的重复性。

综上，本研究建立的TaqMan荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点。在实际生产中，可为PCV3早期流行的分子生物学诊断、病原定量检测提供一种快速有效的技术方法。