原核表达IBDV VP5基因同源dsRNA方法的建立

季刚，俞天奇，张宜娜，周继勇，胡伯里*

(1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2. 浙江大学动物医学系/农业部动物病毒学重点实验室，浙江 杭州 310058)

传染性法氏囊病(infectious bursal disease， IBD)是一种具有高度传染性，免疫抑制性的疾病，病原体主要通过损害鸡的免疫器官法氏囊从而引起鸡的发病死亡。传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组由两个片段A和B组成，A片段编码4个蛋白，分别是衣壳蛋白VP2、支架蛋白VP3、具有水解酶活性的蛋白VP4以及非结构蛋白VP5[1-4]；B片段只编码VP1蛋白，该蛋白具有RNA聚合酶的功能。VP5蛋白与病毒毒力的强弱密切相关，研究其功能有助于更好地了解病毒复制全过程。RNA干扰技术可阻断靶基因的表达进而阻断蛋白的表达，利用其研究蛋白功能，获得能使目的基因降解的dsRNA是实施RNA干扰技术的前提。

目前，在研究基因功能的过程中，相应基因的dsRNA主要是通过商业化的试剂盒合成。虽然该方法能获得基因dsRNA，但合成过程中所需的经济成本以及大量时间的耗费限制了dsRNA的大批量生产，制约了对其功能的研究。而在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-B-thiogalactoside，IPTG)的诱导下，利用大肠杆菌HT115(DE3)可以大量合成dsRNA,且可以显著降低成本[5]。本文通过构建带有目的基因VP5的RNA干扰载体，利用IPTG诱导大肠杆菌HT115(DE3)表达并合成IBDV-VP5-dsRNA，为进一步研究VP5基因功能打下了基础。

1 材料与方法

1.1 RNA干扰载体

L4440质粒，由中国林业科学研究院资源昆虫研究所杨璞老师赠送；反向遗传质粒pcdna 3.0-A，由本实验室保存。

1.2 菌株

大肠杆菌HT115(DE3)型菌株，由中国农业大学昆虫学系和农业部有害生物监测与绿色防控重点实验室沈杰老师馈赠。

1.3 主要试剂

AceQ qPCR Probe Master Mix、Hiscript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×taq plus master mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，四环素(Tet)、溶菌酶(上海生工生物工程有限公司)，质粒提取试剂盒(TIANGEN公司)，DNA纯化回收试剂盒、PCR清洁回收试剂盒(AXYGEN公司)，核酸Marker (TaKaRa公司)，Trizol(上海普飞公司)等。

1.4 dsRNA合成引物的设计

目的基因的上游引物的5′端和下游引物3′端分别加上NheⅠ、XbaⅠ酶切位点。

1.5 重组载体L4440-IBDV-VP5的构建

1.5.1 目的片段的克隆与回收

使用phanta Max Super-Fidelity DNA酶，以pcdna3.0-A载体为模板，用表1中的有关引物进行PCR反应,延伸时间设置为30 s，35个循环反应。反应结束后将PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切取凝胶，参考DNA凝胶回收试剂盒方法回收DNA片段，测完浓度后并将回收产物置于4 ℃保存备用。

表1 dsRNA合成引物和重组质粒鉴定引物

1.5.2 胶回收产物与L4440载体酶切、连接、转化

利用NheⅠ、XbaⅠ37 ℃过夜酶切质粒与胶回收片段，使用T4连接酶进行连接反应，按照相应的比例在16 ℃下连接4 h。从-80 ℃冰箱中取HT115(DE3)感受态细胞并迅速放入冰上，待感受态细胞融化后，吸取10 μL连接产物加入到感受态细胞中，用移液器轻轻吹打使其混匀，并将其放置冰上冰浴30 min。随后，将其再放入42 ℃水浴锅中热激90 s，热激后迅速置于冰上2～3 min。加入无抗的LB液体培养基，混匀后放入37 ℃摇床培养2 h，低速离心，弃掉部分上清。将菌体重悬后涂布于含有氨苄青霉素和四环素抗性的LB平板上，将平板倒置放于于37 ℃培养箱培养16 h。

1.5.3 阳性克隆的筛选

待平板上长出细菌后，挑取7个单菌落放于装有1 mL的含有四环素抗性的LB培养基中，并放入摇床培养2 h，分别利用表格1中的上下游引物test-F、test-R菌液PCR鉴定。菌液PCR程序参考1.5.1中的反应程序。反应结束后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，通过观察条带大小，500 bp左右即为正确条带。在超净工作台中吸取部分菌液送与公司测序，剩余菌液保存于4 ℃备用。待测序正确后，扩大培养菌液并参照质粒小提中量试剂盒(TIANGEN)说明书进行质粒提取。

1.6 IBDV-VP5-dsRNA的诱导表达

取过夜培养的菌液，将其按照1∶500比例接种于100 mL的含有氨苄和四环素抗性的LB液体培养基中。将培养基放入37 ℃振荡培养2 h左右，至菌液呈现云雾状即细菌达到对数生长期时，吸取1 mL菌液放入EP管中作为诱导前菌液备用，在剩余培养基中加入经过无菌处理的终浓度约为0.4 mmol/L的诱导剂IPTG，继续放入37 ℃振荡培养4～5 h。收集菌液并以5 000 r/min的转速离心10 min，收集菌体，将收集到的菌体用浓度为500 mg/mL的溶菌酶常温裂解10～20 min，并用Trizol法提取dsRNA，dsRNA用高压过后的DEPC处理水溶解，并从溶解液中取出少量测定其浓度。最后，用降解DNA(DNaseI)和降解单链RNA(RNaseA)消化处理1 h，以获得较纯的dsRNA，并进行电泳检测。

1.7 dsRNA原核表达条件的优化

分别于对数生长期添加不同量的IPTG，使其终浓度分别为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L和0.6 mmol/L，继续诱导4 h，取样提取dsRNA。分别于对数生长期放入16 ℃、37 ℃继续诱导4 h，取样提取dsRNA。分别于对数生长期，诱导0、1、2、3、4、5、6、7 h，提取dsRNA。通过RT-qPCR检测dsRNA相对表达量，确定最佳表达条件。以U16S为作标准化的内源对照。U16S引物的序列为：U16S正向，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′和U16S反向，5′-TATTACCGCGGCTGCTGGC-3′。dsRNA引物序列为：IBDV-VP5正向，5′-GTCAGTAGAGATCA-3′和IBDV-VP5反向，5′-ATGACAAACCTGCAAGATCA-3′。

2 结果与分析

2.1 目的基因的克隆

以本实验室保存的含有传染性法氏囊病毒A片段全长的反向遗传质粒pcdna 3.0-A为模板，进行目的片段的扩增，获得500 bp左右片段，如图1所示。

M.Marker；1.带有酶切位点的VP5片段图1 目的基因的克隆

2.2 重组载体L4440-IBDV-VP5的鉴定

随机挑取7个单菌落进行菌液PCR鉴定，阳性克隆产物应为500 bp左右(图2)，琼脂糖凝胶电泳检测结果与预期片段大小基本相符，菌液测序结果也正确。

M.Marker；1～7.克隆载体菌液PCR鉴定；8.阴性对照图2 重组载体L4440-IBDV-VP5菌液PCR鉴定

2.3 原核诱导HT115(DE3)表达IBDV-VP5-dsRNA

将在IPTG诱导前后收集的菌液低速离心，得到的菌体用溶菌酶处理后，用Trizol法提取细菌总RNA。将提取产物经DNaseI(单链或双链DNA)和RNaseA(单链RNA)消化处理后分别通过琼脂糖凝胶电泳检测。已知目的基因VP5的长度约为500 bp，经IPTG诱导的菌液能够表达出相应大小的dsRNA，且未经诱导的菌液未能表达出dsRNA，结果如图3所示。

M.Marker；1.IPTG诱导前提取的dsRNA；2.IPTG诱导后提取的dsRNA；3. 经DNaseI、RNaseA处理后的dsRNA图3 dsRNA的诱导表达

2.4 dsRNA原核表达条件的优化

2.4.1 不同IPTG浓度对dsRNA诱导表达产量的影响

分别于对数生长期(OD600=0.6)添加不同量的IPTG，使其终浓度分别为0.2、0.4和0.6 mmol/L，继续诱导4 h，随后提取dsRNA并通过RT-PCR检测dsRNA相对表达量。由图4可以看出，不同浓度的IPTG对于dsRNA 表达量有不同的作用，dsRNA的表达量随着IPTG浓度的增高而增高。当IPTG终浓度为0.6 mmol/L的左右，dsRNA的表达量相对较高，但差异不显著(P>0.05)。

图4 不同IPTG浓度对dsRNA诱导表达产量的影响

2.4.2 不同诱导时间对dsRNA表达量的影响

分别于对数生长期(OD600=0.6)添加终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，在37 ℃分别诱导0、1、2、3、4、5、6、7 h后，提取dsRNA并通过RT-PCR检测dsRNA相对表达量，得到不同诱导时间与dsRNA诱导表达产量的关系。由图5可以看出，诱导时间对于dsRNA表达量是有影响的，随着诱导时间的延长，dsRNA的表达量先增大后减少。当诱导时间为5 h时，dsRNA的表达量相对较高。

图5 不同诱导时间对dsRNA表达量的影响

2.4.3 不同诱导温度对dsRNA表达量的影响

分别于对数生长期(OD600=0.6)添加同量的IPTG，使其终浓度为0.6 mmol/L，分别在16 ℃和37 ℃诱导5 h后，提取dsRNA并通过RT-PCR检测dsRNA相对表达量，得到不同诱导温度对dsRNA诱导表达产量的关系。不同诱导温度对于dsRNA表达量是有影响的，在相同IPTG 浓度下，当诱导温度为37 ℃时，dsRNA的表达量相对较高。

综上，针对该菌株，当IPTG诱导终浓度为0.6 mmol/L，在37 ℃诱导5 h，dsRNA相对表达量最高。

3 讨论

RNA干扰技术可以高效沉默同源mRNA[6-8]，进而阻断靶基因的表达[9-10]，是研究基因功能的有效方法[11-13]，而dsRNA的获取是进行该研究的前提。目前，通过商业化试剂盒合成dsRNA的成本太高且操作复杂，原核表达相应基因dsRNA方法的建立，为dsRNA的获取提供了便利，其仅需少量菌液即可获取大量目的基因的dsRNA。在利用基因工程菌原核表达dsRNA的方法中，IPTG的使用会使成本增加，探索IPTG最适诱导浓度是减少成本的重要途径之一。通过对IPTG的浓度的摸索确认最佳的IPTG的使用浓度，同时通过对诱导时间以及诱导温度的探究确定了最佳的诱导时间与诱导温度，使通过原核表达获得dsRNA的效率显著提高。

通过建立原核表达dsRNA的方法，在快速大量获取VP5同源基因dsRNA后，可利用其特异性抑制VP5蛋白的表达，为进一步分析该蛋白在病毒复制过程中的作用奠定基础，同时也为其他病毒蛋白相应基因dsRNA的表达提供借鉴。