新型鸭细小病毒SYBR Green Ι 荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

周洁文，汤傲星，戚睿斌，朱 杰，李传峰，郭 鑫，刘光清

（1.中国农业大学动物医学院，北京100193；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

新型鸭细小病毒（Novel duck parvovirus，NDPV）是一种与鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）的同源性高达90%以上，主要引起鸭“大舌病”的病原。NDPV基因全长约为5100 bp，属于细小病毒科细小病毒亚科依赖病毒属成员[1-3]。

该病感染鸭后主要造成鸭喙萎缩变短、舌头肿胀伸出，体重下降甚至侏儒。自2015年以来，该病在我国安徽、山东、河北、江苏、湖南等多地的鸭场中广泛流行，致死率可达2%～10%，发病率可达10%～100%，残淘率可高达80%[1-3]，给养鸭业带来巨大的经济损失。

目前，针对该病的检测手段主要有传统病原分离检测、PCR方法[4-5]，以及免疫学诊断方法包括间接免疫荧光法[6]、免疫酶联吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法[7]、乳胶凝集抑制试验检测法[8-9]等。传统病原分离虽然结果可靠，但是操作过于复杂，对于实验条件要求较高，耗时也较长。常规PCR方法虽然操作简便，但灵敏度不高，巢式PCR、半巢式PCR虽然灵敏度较高，但是定量有一定难度，并不适合多样本的检测。免疫诊断学方法对取样要求及实验条件要求较高，操作过程相对复杂，操作难度较大，操作时间较长，且成本较高，不利于进行早期、快速检测。本研究成功建立了一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度高、易于定量，操作较简单，为新型鸭细小病毒的监测奠定了坚实基础。

1 材料与方法

1.1 病毒与主要试剂 NDPV、鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）、禽流感（Avian influenza virus，AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）、鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）、鸭星状病毒（Duck astrovirus，DAstV）等均由中国农业科学院上海兽医研究所小动物传染病创新团队实验室保存；LATaq酶、T4连接酶、pMD19-T载体、DL2000 DNA marker、DH5α、TB Green® PremixExTMTaqⅡ试剂均购自宝生物工程（大连）公司；cador® Pathogen 96 QIA cube® HT Kit购自德国QIAGEN公司；Tissue DNA kit购自美国OMEGA公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 引物设计 根据GenBank收录的NDPV全基因序列（KX384726），针对其结构蛋白VP3基因的保守区域，利用Oligo 6.0设计1对引物，VP3-F：TCAA TCGCTTCCACTGCCACTTC，VP3-R：ATCCTGC GTTGTGACTTCCTTGAC。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 标准质粒的制备 利用Tissue DNA kit提取NDPV阳性尿囊液样品DNA，以其为模板，利用引物VP3-F/R扩增出131 bp的目的基因片段，将其克隆至pMD19-T载体上，构建重组质粒pMD19-TVP3-131，测序正确后作为标准阳性质粒，其拷贝数为5.17×1010/μL，-20℃保存备用。

1.4 荧光定量PCR的反应条件 将重组质粒pMD19-T-VP3-131用无菌去离子水进行10倍倍比稀释，选择拷贝数5.17～5.17×107/μL进行SYBR GreenⅠ荧光定量P C R。反应体系（2 0μL）：2×T B GreenTMPremix ExTaqII 10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，上、下游引物VP3-F/R（10 μmol/L）0.8 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板2 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。熔解曲线反应条件是：95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s。

1.5 标准曲线的建立 将标准阳性质粒10倍倍比稀释后使用10-10～10-3的8个稀释梯度作为模板，利用1.4反应条件进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR，绘制其标准曲线和熔解曲线。

1.6 重复性检测 使用浓度拷贝数为5.17×107/μL、5.17×106/μL、5.17×101/μL的重组质粒作为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR，分析NDPV的变异系数，用来验证该方法的重复性。

1.7 特异性检测 以鸭呼肠孤、鸭肝炎、鸭坦布苏病毒基因组的cDNA为模板，设无菌去离子水为阴性对照及NDPV为阳性对照进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增，以验证其特异性。

1.8 灵敏度检测 将阳性质粒进行10倍倍比稀释作为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增，并设置阴性对照，测定该方法的灵敏度。

1.9 临床样品检测 分别在安徽、江苏及山东地区的鸭场采集48份疑似新型鸭细小病毒感染的病例样品，研磨后抽提DNA进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增，计算阳性样品数量及阳性率。以上检测的48份样品用常规PCR方法进行复核，并计算两种检测方法结果的符合率。

2 结果

2.1 标准质粒制备结果 利用引物VP3-F/R扩增出131 bp的目的片段，与预期大小相符（图1）。将目的片段回收纯化，连接于pMD19-T载体上，提取质粒，计算质粒浓度为160 ng/μL。质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果显示，该片段序列正确。

图1 VP3-131 PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results of VP3-131

2.2 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线的建立 将10倍倍比稀释的标准质粒5.17×101～5.17×107拷贝/μL共计8个稀释度的模板按照本实验建立的方法进行PCR扩增，根据扩增结果绘制标准曲线（图2）Y=-3.595X+38.62，R2=0.999，阴性对照显示没有特异扩增。熔解曲线显示，在82.03℃出现单一特异峰（图3）。

2.3 重复性试验 将不同稀释度标准品5.17×107/μL、5.17×105/μL、5.17×101/μL进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR，并通过统计学软件进行分析，结果显示，批内变异系数0.10%～1.83%批间变异系数1.46%～1.89%（表1），该结果表明本实验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

2.4 特异性试验 以DRV、DHV、DTMUV的cDNA为模板，进行SYBR Green I荧光定量PCR的特异性试验。结果显示，DRV、DHV、DTMUV均未出现特异性条带（图4）。

图2 荧光定量PCR标准曲线Fig2 Standard curve of fluorescence qPCR

图3 荧光定量PCR熔解曲线Fig.3 Melting curve of fluorescence qPCR

表1 NDPV荧光定量PCR重复性试验Table 1 Repeatability of NDPV fluorescence qPCR

图4 NDPV荧光定量PCR特异性检测Fig.4 Specific detection of NDPV fluorescence qPCR

2.5 灵敏度试验 以标准质粒DNA的8个稀释度（10-3～10-10）作为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增。结果显示：当PCR反应体系中模板浓度为5.17拷贝/μL时，仍然可以产生特异性扩增，并且在阴性对照中未扩增出目的条带。

2.6 临床样品检测 采用本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测采自安徽、江苏及山东地区的鸭场48份疑似新型鸭细小病毒病组织病料，结果显示，其中检测出阳性样品34份、阴性样品14份，阳性率为70.8%。其中，安徽鸭场共采集24份样品，15份样品为阳性，江苏鸭场共采集8份样品，4份样品为阳性，山东地区鸭场共采集16份样品，15份样品为阳性。同时，将采集的48份样本用常规PCR方法进行检测，结果显示，阳性样品30份，阳性率62.5%，其中安徽鸭场14份样品为阳性，江苏鸭场4份样品为阳性，山东鸭场12份样品为阳性，常规PCR检测的阳性样品结果与本研究的结果一致，且有4份样品普通PCR检测为阴性，但本研究建立的方法检测为阳性，由此，说明本研究建立的方法灵敏度更高。

3 讨论

3个结构蛋白（VP1、VP2、VP3）共用一个终止密码子，其中VP2、VP3为病毒的免疫保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体，由于基因的特殊结构，二者含有相同的抗原决定簇，在NDPV的免疫诊断研究中具有重要地位[10-11]。

尽管在基因组遗传演化分析上NDPV与GPV有很高的同源性，但在临床表观症状上，新型鸭细小病毒病与经典小鹅瘟有一定区别，不仅如此，二者在宿主感染谱上也有较明显差异。新型鸭细小病毒病一般在鸭群中发病，造成鸭严重的生长阻滞。此外，一些分离株可以感染小鹅[12]。鸭群感染NDPV后早期一般没有明显临床表现，在2周甚至更大日龄才能有典型病理变化，因此针对该病的早期诊断就必须借助于实验室方法。

2015年至今，新型鸭细小病毒病一直广泛流传于中国众多省市的养鸭场[13-14]，给养鸭业造成了不小的经济损失，针对该病的及时发现及有效诊断就显得尤为重要。本研究针对VP3基因保守区域设计引物，建立的荧光定量PCR方法特异性强、重复性好，组间组内的变异系数均在2%以下。另外，通过复核实验发现，常规PCR方法可检出的阳性样品用本研究建立的方法均能检出，说明该方法准确可信，通过复核试验可以说明，本方法相对常规PCR检测方法更加灵敏。综上所述，本研究建立的新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，操作简便，灵敏度高，样本需求量低，为新型鸭细小病毒病的检测诊断提供了一定的参考依据。