七氟醚通过lncRNA MEG3调控miR-23a-3p对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

陈 丹，刘 佳，吴 丹

(四川大学华西医院 广安医院，四川 广安 638500)

肺癌是男性最常被诊断出的癌症。2018年，约有210万新发病例，在所有癌症类型中排名第一，也是癌症死亡的主要原因，占癌症死亡人数的近五分之一，与大多数国家相比，中国的肺癌死亡率相对较高。预计到2030年，中国的肺癌死亡率可能会增加约40%[1-3]。目前，肺癌切除术是临床上治疗早期肺癌最重要的方法之一[4]。越来越多的证据表明，外科切除术中使用的麻醉剂也具有一定的非麻醉生理作用，这可能会影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移能力[5-6]。七氟醚(Sevoflurane, SEV)是一种临床常用的挥发性麻醉剂，先前的研究表明，七氟醚可能在多种肿瘤中发挥作用，例如肺癌[7]、乳腺癌[8]、宫颈癌[9]。这些报道表明七氟醚在恶性肿瘤中具有潜在的临床应用价值，但其对肺癌细胞恶性行为的分子机制尚未完全阐明。新的资料显示，长链非编码RNA(Long noncoding RNA, lncRNA)Gm15621的过表达通过抑制微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)-133a/Sox4，减轻七氟醚治疗引起的细胞凋亡和炎症反应[10]，lncRNA SNHG1通过下调miR-181b介导七氟醚调控的神经细胞增殖、凋亡和炎症[11]，可见lncRNA和miRNA参与七氟醚的细胞增殖和细胞凋亡调控过程。lncRNA Maternally expressed gene 3(MEG3)在肺癌组织和细胞中低表达[12]，miR-23a-3p在肺癌组织和细胞中高表达[13]，二者在肺癌发生发展中均发挥重要作用。然而，七氟醚是否通过MEG3调控miR-23a-3p来影响肺癌细胞的增殖和凋亡，以及MEG3与miR-23a-3p的靶向调控作用，目前仍不清楚。因此，本研究考察七氟醚对肺癌细胞增殖和凋亡的影响，并结合MEG3与miR-23a-3p，旨在阐明其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 人正常肺粘膜细胞GES-1、肺癌细胞A549购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基、胎牛血清(Fetal calf serum，FBS)购自美国Gibco公司；miR-23a-3p、miR-23a-3p阴性对照miR-con、si-MEG3、si-MEG3阴性对照si-con购自上海吉玛公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司；细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自日本Dojindo公司；细胞凋亡检测试剂盒、二辛可宁酸(Bicinchoninic acid, BCA)蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；兔抗B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、兔抗Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)、兔抗β肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养与处理 细胞GES-1、A549在包含10% FBS、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中生长，并在37℃、5% CO2、饱和湿润的培养箱中培养。七氟醚对细胞的处理参考先前的研究[14]，选取对数生长期的细胞，保持在无菌密闭容器中。容器入口处连接七氟醚挥发器，用于供应七氟醚气体。细胞于1.7%、3.4%、5.1%浓度的七氟醚气体(与95% O2和5% CO2混合)中保持6 h，然后在正常条件下培养24 h，之后进行分析。对照组的细胞仅用95% O2和5% CO2的混合处理。其中，容器中七氟醚的浓度通过PM8060气体监测仪进行监测，监测仪连接到容器的出口。

1.3 细胞分组与转染 实验分组：确定七氟醚最佳作用浓度时，将A549细胞分为对照组(Control组)、1.7% SEV组(细胞给予1.7%七氟醚)、3.4% SEV组(细胞给予3.4%七氟醚)、5.1% SEV组(细胞给予5.1%七氟醚)。之后将A549细胞分为Control组(细胞正常培养)、Control+si-con组(细胞正常培养并转染si-con)、Control+si-MEG3组(细胞正常培养并转染si-MEG3)、SEV组(细胞给予5.1%七氟醚)、SEV+si-con组(细胞给予5.1%七氟醚并转染si-con)、SEV+si-MEG3组(细胞给予5.1%七氟醚并转染si-MEG3)、SEV+miR-23a-3p组(细胞给予5.1%七氟醚并转染miR-23a-3p)，以检测七氟醚对肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响与机制。

细胞转染：A549细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到6孔板，待细胞达70%左右汇合时，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的指示，将miR-con、miR-23a-3p(转染效率为81.25%)、si-con、si-MEG3(转染效率为84.13%)转染至A549细胞中，转染24 h。

1.4 CCK-8检测A549细胞的增殖 收集Control组、1.7% SEV组、3.4% SEV组、5.1% SEV组、SEV+si-MEG3组和SEV+miR-23a-3p组A549细胞，以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板，培养48 h后，每孔细胞加入10 μL CCK-8溶液孵育，1 h后于酶标仪450 nm波长处测量吸光度A值，用于表示细胞活力。

1.5 流式细胞术检测细胞A549的凋亡 选取Control组、SEV组(5.1% SEV)、SEV+si-MEG3组、SEV+miR-23a-3p组A549细胞，遵循细胞凋亡检测试剂盒的规程，在Binding Buffer稀释细胞，收集1×105个细胞，分别加入5 μL 磷脂酰结合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μL碘化丙啶工作液，避光反应，15 min于流式细胞仪评估细胞凋亡。

1.6 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达 向Control组、SEV组(5.1% SEV)、SEV+si-MEG3组、SEV+miR-23a-3p组A549细胞中加入RIPA裂解液以提取蛋白，通过BCA蛋白质测定试剂盒对蛋白定量后，取50 μg蛋白样品进行10%的SDS-PAGE电泳，电转到聚偏二氟乙烯膜。随后将膜放入5%脱脂奶粉封闭，加入1∶1 000稀释的Bax、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，第2天加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育2 h，加入增强化学发光液显影，采用凝胶成像系统扫描分析Bax、Bcl-2蛋白相对表达量。

1.7 qRT-PCR检测MEG3和miR-23a-3p表达 使用TRIzol试剂人正常肺粘膜GES-1细胞和各处理组A549细胞中提取总RNA，用PrimeScriptTMRT试剂盒将RNA逆转录为cDNA，SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR反应。MEG3和miR-23a-3p的表达分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和U6为内参照，由2-ΔΔCt方法计算得出。引物序列为：MEG3上游5’-GGCTGCAGACGTTAATGAGG-3’和下游5’-GAAATGTCGGCTCCATCACC-3’，GAPDH上游5’-AGCCACATCGCTCAG ACAC-3’和下游5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’，miR-23a-3p上游5’-GCGATCAC ATTGCCAGGG-3’和下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，U6上游5’-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3’和下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.8 生物信息学预测和双荧光素酶活性实验分析MEG3与miR-23a-3p的靶向关系 通过starbase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测MEG3与miR-23a-3p存在互补配对的碱基序列。建立含有miR-23a-3p结合位点的MEG3-3′UTR野生型(WT)和突变型(MUT)片段，并分别克隆重组到荧光素酶报告质粒中，以合成MEG3(WT)和MEG3(MUT)质粒。参照方法1.3所述，利用Lipofectamine 2000转染试剂在A549细胞中共转染miR-con或miR-23a-3p与MEG3(WT)或MEG3(MUT)，分别记为miR-con组或miR-23a-3p组。48 h后进行双荧光素酶活性测定。

2 结果

2.1 七氟醚对肺癌细胞A549增殖的影响 CCK-8检测结果如表1所示，与Control组比较，1.7%、3.4%和5.1% SEV组A549的活力显著降低(P<0.05)；与1.7% SEV组比较，3.4% 和5.1% SEV组细胞活力明显降低(P<0.05)；与3.4% SEV组比较，5.1% SEV组细胞活力明显降低(P<0.05)。其中，以5.1%的七氟醚差异最显著，因此后续实验七氟醚的浓度选取5.1%。

表1 不同浓度七氟醚对肺癌A549细胞增殖的影响

2.2 七氟醚对肺癌A549细胞凋亡的影响 流式细胞术和Western blot检测结果如表2和图1、2所示，与Control组比较，七氟醚组A549细胞的凋亡率明显增加，Bax蛋白表达量明显升高，Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。

图1 七氟醚对肺癌A549细胞凋亡的影响

图2 Western blot检测七氟醚对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表2 七氟醚对肺癌A549细胞凋亡的影响

2.3 lncRNA MEG3和miR-23a-3p在肺癌细胞A549中的表达 qRT-PCR检测结果如表3所示，与人正常肺粘膜细胞GES-1组比较，肺癌A549细胞中MEG3表达量明显减少，miR-23a-3p表达量显著增加(P<0.05)。

表3 qRT-PCR检测MEG3和miR-23a-3p在肺癌A549细胞中的表达

2.4 MEG3与miR-23a-3p的靶向关系 生物信息学预测结果如图3所示，MEG3与miR-23a-3p存在互补的核苷酸序列。双荧光素酶活性实验结果如表4所示，与miR-con组比较，miR-23a-3p组明显抑制转染MEG3(WT)细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，而对转染MEG3(MUT)细胞的荧光素酶活性无显著影响(P>0.05)。

图3 MEG3与miR-23a-3p的结合位点

表4 双荧光素酶活性检测肺癌A549细胞中MEG3与miR-23a-3p的靶向关系

2.5 七氟醚通过MEG3抑制miR-23a-3p的表达 qRT-PCR检测结果如表5所示，与Control组比较，Control+si-con组肺癌细胞A549中MEG3和miR-23a-3p的表达无明显差异(P>0.05)；Control+si-MEG3组细胞A549的MEG3表达量明显减少，miR-23a-3p表达量显著增加(P<0.05)；SEV组、SEV+si-con组细胞A549中MEG3的表达量均明显增加，miR-23a-3p表达量均显著减少(P<0.05)。与SEV组比较，SEV+si-MEG3组细胞A549中MEG3的表达量显著降低，miR-23a-3p表达量明显升高(P<0.05)。

表5 qRT-PCR检测各组肺癌细胞A549中MEG3和miR-23a-3p的表达

2.6 七氟醚通过MEG3调控miR-23a-3p对肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响 CCK-8、流式细胞术、Western blot检测结果如表6、图4和图5所示，与Control组比较，SEV组A549细胞的miR-23a-3p表达量、细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著升高，Bax蛋白表达量明显增加，Bcl-2蛋白表达量显著减少(P<0.05)。与SEV组比较，SEV+si-MEG3组和SEV+miR-23a-3p组A549细胞的miR-23a-3p表达量、细胞活力明显升高，细胞凋亡率显著降低，Bax蛋白表达量明显减少，Bcl-2蛋白表达量显著增加(P<0.05)。

图4 七氟醚通过MEG3调控miR-23a-3p对肺癌A549细胞凋亡的影响

图5 七氟醚通过MEG3调控miR-23a-3p对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表6 七氟醚通过MEG3调控miR-23a-3p对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响

3 讨论

七氟醚是一种无色，易挥发且不易燃的液体，具有特殊的气味。在世界范围内，七氟醚被公认为用于临床实践的安全可靠的麻醉剂[15]。近年来，七氟醚在各种肿瘤中的治疗作用逐渐被证实。根据报道，七氟醚可以抑制卵巢癌细胞的增殖[16]、骨肉瘤细胞的凋亡[17]，并降低神经胶质瘤[18]、结直肠癌[19]细胞的迁移和侵袭能力。这些研究揭示了七氟醚的抗肿瘤活性，提示七氟醚可用作治疗癌症的潜在靶标药物。Hirai等[20]的研究显示，七氟醚减慢了两种癌细胞系A549和MCF-7以及非癌MCF10A细胞系的增殖。Wang等[15]的研究结果显示，3%七氟醚对A549细胞进行预处理可以改变几种凋亡相关的miRNA，增加肺癌细胞的凋亡率，并减少癌细胞的数量。然而，关于七氟醚对肺癌细胞增殖和凋亡的机理尚不清楚。在本研究中，我们用1.7%、3.4%和5.1%浓度的七氟醚处理A549细胞，发现七氟醚显著抑制了肺癌细胞的增殖。并且，随着七氟醚浓度的增加，其对肺癌细胞的抗增殖作用越显著。后续研究针对5.1%浓度的七氟醚展开实验。

促进肿瘤细胞凋亡是细胞毒性抗肿瘤药的重要特征之一[21-22]。在本研究中，流式细胞仪的结果表明，七氟醚可以提高A549细胞的凋亡率。Bcl-2和Bax是参与细胞凋亡过程的关键调节基因[23]。Yang等[24]报道了七氟醚诱导头颈部鳞状细胞癌FaDu和CAL-27细胞的凋亡，以及抑制Bcl-2的表达。本实验观察到同样的结果，即七氟醚明显下调Bcl-2的表达，而显著上调Bax的表达，表明七氟醚通过调节Bcl-2/Bax轴促进肺癌细胞的凋亡。总体而言，这些结果表明七氟醚可能通过抑制肺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡，发挥其抗肿瘤功能，与前人报道[25]相符。

lncRNA是一类进化上高度保守的非编码RNA，其长度超过200个核苷酸。LncRNA在不同的细胞过程起着重要作用，如基因表达的调节，细胞增殖、凋亡和转移[26]。MEG3是已鉴定的lncRNA之一，在癌症异常表达，被证明在许多癌症中起抗肿瘤作用，例如，乳腺癌、肝癌、胶质瘤、结直肠癌，宫颈癌等[27]。非小细胞肺癌组织、A549和HCC823细胞株中MEG3的表达明显低于正常组，MEG3过表达导致A549细胞凋亡增加，还可抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2并促进细胞凋亡促进因子Bax的表达，MEG3的这些作用是通过竞争性结合miR-7-5p来调节BRCA1表达而实现的[28]。本项研究检测到，肺癌细胞A549中的MEG3水平显著低于正常肺粘膜细胞GES-1，这提示MEG3可能抑制肺癌细胞的进展。Xia等[29]研究指出，MEG3通过减弱肺癌化学疗法中的自噬水平，从而提高长春新碱在肺癌化疗中的敏感性。可见，MEG3参与一些药物治疗肺癌的进程。接下来，通过siRNA转染建立敲减MEG3，结果表明，敲减MEG3逆转了七氟醚抑制A549细胞增殖、miR-23a-3p表达和Bcl-2蛋白表达的作用，并逆转了其促进细胞凋亡和Bax蛋白表达的作用，证实了MEG3在七氟醚抗肺癌中的潜在作用。

lncRNA充当miRNA的海绵，并消除这些miRNA对它们的靶基因的内源性抑制作用[30]。本实验观察到肺癌细胞A549中miR-23a-3p表达量上调，与莫晓媚[13]的报道相同。利用生物信息学预测工具发现，MEG3的3′UTR与miR-23a-3p结合高度保守。随后的双荧光素酶活性实验则验证了MEG3对miR-23a-3p的靶向调控。在肺癌细胞中过表达miR-23a-3p可以逆转七氟醚对细胞A549增殖和Bcl-2蛋白表达的抑制作用，以及对细胞凋亡和Bax蛋白表达的促进作用。这些数据表明，MEG3通过靶向miR-23a-3p，可能是七氟醚调控肺癌细胞增殖和凋亡的重要途径。

综上所述，在当前的研究中，我们探讨了七氟醚处理对肺癌细胞的影响及其功能机制。结果发现，七氟醚可以抑制肺癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，显示出一定的抗肿瘤活性，其作用可能是通过lncRNA MEG3负向调控miR-23a-3p的表达来实现的，表明七氟醚可能是肺癌治疗中的潜在药物。