千里光苯丙氨酸解氨酶基因克隆与系统进化分析

李 林，左青青，谢 欣，刘朝波，陈 立，张 俊，钱 刚

(1.遵义医科大学 基础医学院细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 第一临床学院，贵州 遵义 563099)

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.Ex D.)，为菊科(Composite)千里光属多年生草本植物，其性寒、味苦，具有清热解毒、明目、止痒等功效，多用于风热感冒、目赤肿痛、泄泻痢疾、皮肤湿疹疮疖[1-2]等治疗，是我国应用历史悠久的传统中药。现代药理学研究表明，千里光中主要含有生物碱类、酚酸类、黄酮类、萜类等多种成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化及清除自由基和毒理等作用[3]，也是千里光抗菌作用的有效成分[4]。而从代谢合成上看，植物酚酸类、黄酮类化合物的苯丙基骨架主要通过苯丙烷代谢途径合成[5]，结构上看生物碱类、菲类、联菲类等化合物均是具有苯环结构的化合物，其对应苯丙基单元主要由苯丙烷代谢通路提供。因此，作为苯丙烷途径的限速酶的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)，也被认为是上述化合物合成途径中的重要酶，是药用植物化学成分合成以及调控研究中的重要内容。此外，PAL也参与植物的生长发育等生物学过程，对抵御病虫害、防紫外线及构成植物支撑系统等具有重要作用[6]。目前国内外对PAL的研究报道较多，但主要集中在它的提取纯化、抗逆境、生理作用等方面[7]，关于千里光苯丙氨酸解氨酶的研究还未见报道。

本研究中对具有良好抗菌性的千里光材料中的苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆，对其编码蛋白进行分子特征及系统生物学进化分析，为分析高等植物PAL的基因结构研究提供基础资料，对揭示千里光药用成分合成乃至抗菌性状机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂 试验材料：本课题组采自贵州省遵义地区的野生千里光，并经抗菌性实验(MIC，最低抑菌浓度)证实具有良好抗菌性，且材料间抗菌水平显著差异(SC32>SC35)仪器：冷冻离心机(Thermo MICRO 21/21R型)，凝胶成像仪(BIO-RAD Gel DocTM XR+型)，水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司DYCP-31DN型)，紫外分光光谱仪(Eppendorf AG 22331Hamburg型)。试剂：总RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)购自天根公司；cDNA第一链合成试剂盒(SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit)购自宝生物公司；其它常规试剂购自擎科生物技术公司。

1.2pal基因克隆 以NCBI数据库中下载的黑心菊(Rudbeckiahirta)pal核酸序列(gi:EF070337.2)与千里光转录组数据库(SC35:SAMN10688662,SC32:SAMN10688663)进行比对，将其中得分最高的序列(Transcripts)挑出作为千里光pal候选序列，运用NCBI的BLAST在线分析软件进行候选千里光pal核苷酸序列比对分析，并利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析核苷酸序列的开放阅读框，并以此序列设计全长引物。

采用 TRIzol 法分别提取SC32和SC35千里光叶片总RNA，DNase I处理去除其中残留基因组DNA,根据反转录试剂盒说明书合成第1链cDNA(Transgene,Cat:AT301-02)。以反转录获得的cDNA为模板，Themo公司Taq酶(Cat:F534S)，基因特异引物(SCPAL1F:5'-ACCGACCCATATTCACATT,ScPAL1R:5'-CTCATTCACTCATTCC-TTCCTA)进行全长扩增。PCR程序，95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环，72 ℃10 min。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带(天根，Cat:DP209-03)，连接转化(擎科，TSV-007BS)，挑取克隆、送样测序(上海生工)。

1.3 序列的生物信息学分析 对获得的具有ORF阅读框的全长核酸序列采用Expasy Prot Param(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析千里光苯丙氨酸解氨酶的分子量、等电点和氨基酸组成；用NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对千里光苯丙氨酸解氨酶磷酸化位点的预测；用ignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对预测蛋白信号肽进行分析；CD-Searchhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，MEME(http://meme-suite.org/)分析蛋白质保守结构域；MEGA6.0进行多物种pal基因系统进化树构建。

2 结果

2.1 千里光苯丙氨酸解氨酶基因克隆 以黑心菊(Rudbeckiahirta)pal基因核酸序列(gi:EF070337.2)搜索千里光转录组数据库，挑选出1个高度相似的full length reads作为千里光苯丙氨酸解氨酶的候选序列。以此核酸序列设计包含整个ORF阅读框的特异引物(ScPAL1F/R)，以SC32与SC35的cDNA为模板，扩增分别获得长度约为2 100 bp片段(见图1)。经回收、克隆测序检测，结果显示SC32与SC35中该序列全长均为2 159 bp，与转录组拼装的核酸序列一致。ORF finder查找开放阅读框发现，该序列包含一个完整的开放阅读框，全长2 124 bp，编码708个氨基酸残基。以该序列作为候选千里光pal基因，进行后续生物信息学分析。

M:Trans 2K DNA maker；1:SC32；2：SC35。

2.2 PAL蛋白序列特征分析 为明确候选千里光pal基因是否属于苯丙氨酸解氨酶家族成员，将其在理化性质与结构上与拟南芥、烟草、籼稻等模式植物、近缘植物的PAL家族成员进行了比较。分析来源不同的PAL蛋白进行理化性质发现，各物种的氨基酸序列包含残基数为707～723，分子量77.76 ～78.52 kDa，表明各苯丙氨酸解氨酶基因在序列长度与分子量上无太大差异；而其等电点与潜在磷酸化位点分析发现15个不同物种PAL的氨基酸等电点范围为5.41～8.14，潜在磷酸化位点为53～66个，表明其氨基酸组成与结构有较大差异(见表1)。采用SignalP对信号肽进行预测，所选用的不同物种的PAL均无信号肽，表明PAL是非跨膜蛋白，可能分布于细胞质及内质网上，本实验所得千里光PAL蛋白也符合此特点。

表1 不同物种的PAL蛋白的序列特征

以黑心菊、雪莲、紫茎泽兰与千里光进行苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列比对，结果表明4个物种的氨基酸序列高度相似(92.22%)，其中内部序列上相似度高，但N端存在较大差异，是序列间长度差异形成的主要区域。同时，InterPro在线分析发现，千里光苯丙氨酸解氨酶具有保守结构域phe_am_lyase(TIGR01226，氨基酸位点：16-697)，属于Lyase class I_like 超基因家族成员，其活性位点(GTITASGDLVPLSYIAG，189～206)与黑心菊和雪莲相同，仅与紫茎泽兰有1个位点差异(见图2)。

黑心菊(gi:EF070337.2)，雪莲(gi:KR811215.1)，紫茎泽兰(gi:GQ259805.1)；黑色背景表示同源性为100%，紫色背景表示同源性为75%，蓝色背景表示同源性为50%，“·”表示氨基酸缺失。

2.3 PAL系统进化构建与保守结构域分析 从NCBI中下载包括拟南芥、烟草、水稻等模式植物与近缘物种PAL氨基酸序列(E-value =0.0)，采用邻接法(NJ)建系统进化树，比较分析15个物种中该基因的进化与亲缘关系，结果显示千里光(SsPAL)与青蒿(PWA39244.1)、雪莲(KR811215.1)的苯丙氨酸解氨酶归于一个亚支，表明在进化上具有较近的亲缘关系，与籼稻(CAA61198.1)、拟南芥(AAP59440.1)分支距离最大，进化上亲缘关系较远(见图3A)。在线查找序列保守结构域表明，全部序列均具有6个保守结构域顺序排列，在第2、3个motif 间的序列要长于其它相邻两个结构域(见图3B、C)，表明pal基因在进化上较为保守。

青蒿(gi:PWA39244.1)，向日葵(gi:XP_022000808.1),雪莲(gi:KR811215.1),白菊花(gi:AGU91428.1),烟草(gi:XP_009625397.1),辣椒(gi:PHU06526.1),长春花(gi:BAA95629.1),毛白杨(gi:KP770017.1),甘蓝型油菜(gi:XM_009117772.3),前胡(gi:AYJ76815),紫茎泽兰(gi:GQ259805.1),籼稻(gi:CAA61198.1),拟南芥(gi:AAP59440.1),黑心菊(gi:EF070337.2),千里光S.sPAL。

3 讨论

苯丙氨酸解氨酶是植物由初生代谢转入次生代谢的重要酶类，也被证明参与植物的生长、抗病、次生代谢等重要的生命活动中。近年来，在中药材中关于苯丙氨酸解氨酶基因的研究也很多，石斛[8]、白及[9]、丹参[10]等重要中药材中的pal基因的结构信息得到了解析。本文首次对千里光的pal基因的序列进行生物信息学分析，为千里光的抗菌性为代表的药用性状的研究提供基础资料。

本研究通过筛选千里光转录组测序并通过基因特异引物进行扩增验证，获得全长为2 159 bp，编码708个氨基酸的苯丙氨酸解氨酶蛋白质。通过与近缘物种黑心菊、紫茎泽兰的苯丙氨酸解氨酶基因比对发现高度的相似性，进一步通过生物信息学分析千里光PAL的磷酸化位点、亲疏水性、信号肽等信息，表明与其它植物的PAL氨基酸序列在保守结构域、活性位点上表现出一致性。千里光PAL无信号肽，与石斛[8]相同，属于非分泌蛋白。包括千里光在内的15种植物PAL氨基酸序列的进化分析表明，千里光PAL在进化上与青蒿、雪莲具有更近的亲缘关系。

植物酚酸[10]、、类黄酮[11]、生物碱[12]等次生代谢产物均是千里光的抗菌药用成分，其合成积累与植物苯丙烷代谢途径及关键酶具有密切的关系，作为该途径关键酶的苯丙氨酸解氨酶可能在千里光的抗菌性状形成与组成上均具有重要的意义。因此，对该酶的基因进行克隆，并进行序列与系统进化分析对于进一步解析千里光类黄酮与酚酸类化合物为代表的抗菌性状产生机制研究具有积极作用。