PKG 信号通路在ACS 患者PCI 术后血管内皮损伤中作用

董丹红，庞玺倬，李 琳

（昆明医科大学第一附属医院心内科，云南昆明 650032）

心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion，IR）导致严重的心律失常、心肌坏死面积扩大、心脏破裂甚至死亡[1]。血管内皮细胞是IR 损伤中重要的靶细胞，是IR 损伤的始发及重要影响因素[2]。血管内皮通过其屏障和分泌功能，成为影响心血管疾病发生、发展以及再灌注损伤的关键环节[3]。

缺血后血管内皮损伤以血管内皮依赖性舒张损伤为典型特征，尤以一氧化氮（nitric oxide，NO）介导的血管内皮舒张为代表。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活化左-精氨酸后产生NO，激活鸟苷酸（GC），产生cGMP，引起cGMP 依赖的蛋白激酶（protein kinase G，PKG）介导的血管舒张 。eNOS/cGMP/PKG 对内皮依赖的舒张有重要作用。cGMP/PKG 信号通路调节血管内皮细胞的运动、迁移和增殖，对血管新生和血管的通透性及其重要。内皮依赖的血管舒张主要是由eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信号通路介导的，NO/cGMP/PKG 通路在IR 损伤时具有心脏保护作用[4]。课题组研究发现，PKG 通路与IR 致血管内皮损伤保护作用有关[5]。

经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者的重要治疗手段，PCI 术后可导致心肌IR 损伤，但是否会导致血管内皮功能损伤及PKG 信号通路在其中的作用，目前尚未见报道。本研究旨在探讨ACS 患者PCI 治疗与血管内皮功能损伤的关系，以及eNOS/NO/PKG 信号通路的相关因子在其中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究纳入2015 年6 月至2016 年1 月收住昆明医科大学第一附属医院心内科确诊为ACS 的患者52 例，均接受冠脉造影术，必要时行PCI 术，住院期间均接受冠心病药物治疗。所有患者按照是否接受PCI 治疗分为PCI 组（n=33）和非PCI组（n=19）。入选标准：确诊ACS 并行冠脉造影术的患者，ACS 诊断标准参考中国相关指南[6-7]。排除标准：既往发生过ACS，且在3 个月内接受过PCI 治疗；3 个月内发生过脑梗死、肺栓塞及严重阻塞性肺疾病；血流动力学不稳定；严重的心律失常；有严重肝、肾、肺功能损害；严重感染；妊娠；依从性差的患者。所有入试者均签署知情同意书。

1.2 血流介导的血管舒张（flow mediate dilation，FMD）测定

所有患者入院后6 h 及术后24 h（PCI 组为PCI 术后，非PCI 组为冠脉造影术后）采用血管内皮功能检测仪（上海曙诚医疗科技发展有限公司，UNEX EF）测定FMD。患者在安静状态下，取仰卧位，连接心电、血压监测，右上肢外展15°，用机载超声探头置于肘上2～5 cm 处寻找并锁定靶血管（即右上臂肱动脉），取肱动脉纵切面进行扫描，用二维超声寻找并测量右上肢肱动脉内径，测值取三个心动周期的平均值。首先测量舒张末期血管内径（D0），获得基础值后，测量患者血压，并根据测量的血压值设定袖带压力。阻断血流过程，袖带将阻断肱动脉血流5 min，之后释放袖带气体而引起动脉内反应性充血，在放气后的60～90 s 内进行扫描，测量肱动脉内径（D1）。最后根据公式[（反应后管腔内径-管腔基础内径）/管腔基础内径]得出FMD 的值。

1.3 外周血eNOS、NO、PKG 浓度检测

入院后3 h 及术后6 h 分别抽静脉血，置于枸橼酸钠抗凝管中，4℃放置30min 后，1 000 r/min，离心15 min，收集血清冻存于-80℃低温冰箱。采用ELISA 法，分别使用Human eNOS ELISA（NEOBIOLAB，HN0031）、Total Nitric Oxide and Nitrate Nitrite Parameter Assay（R&D，KGE001）和Human PKG ELISA Kit（LSBio，LS-F21271）试剂盒检测eNOS、亚硝酸盐和PKG 浓度，按试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学处理

应用SPSS 18.0 软件进行统计分析。计数资料以例（%）表示，正态分布的计量资料用（）表示。计数资料采用χ2检验，四格表有理论频数小于1 时，采用四格表确切概率法；PCI 术前、术后自身对照采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验，相关性采用Pearson 相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 ACS 患者PCI 组及非PCI 组基线信息比较（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表1 ACS 患者PCI 组及非PCI 组基线信息比较（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

注：LVEF 为左室射血分数，LVEDD 左心室舒张末期内径，ACS 为急性冠脉综合征，ACEI 为血管紧张素转化酶抑制剂，ARB 为血管紧张素受体拮抗剂。

2 结果

2.1 基线资料比较

PCI 组和非PCI 组患者基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 FMD 比较

PCI 组FMD 值术后较术前降低（P＜0.05），PCI 组较非PCI 组术后FMD 值降低（P＜0.05），见表2。

2.3 eNOS 浓度比较

PCI 组和非PCI 组患者术后较术前eNOS 浓度均下降，差异均有统计学意义，而PCI 组术后较术前降低更明显（P＜0.05），术后eNOS 浓度PCI 组较非PCI 组降低（P＜0.05），见表3。

2.4 亚硝酸盐浓度（反映NO 含量）比较

PCI 组亚硝酸盐浓度术后较术前降低（P＜0.01），术后亚硝酸盐浓度PCI 组较非PCI 组降低（P＜0.01），见表4。

2.5 PKG 浓度比较及相关性分析

PCI 组PKG 浓度术后较术前显著降低（P＜0.05），术后PKG 浓度PCI 组较非PCI 组降低（P＜0.05），见表5。PCI 组术前的PKG 浓度与术后FMD 值呈正相关（r=0.478，P=0.005），见图1。

表2 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后FMD 比较（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

表2 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后FMD 比较（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

与PCI 组手术前比较，*P＜0.05；与非PCI 组手术后比较，△P＜0.05。

表3 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后eNOS 浓度比较（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表3 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后eNOS 浓度比较（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

与PCI 组手术前比较，*P＜0.05；与非PCI 组手术后比较，△P＜0.05；与非PCI 组手术前比较，#P＜0.05。

表4 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后亚硝酸盐浓度比较（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表4 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后亚硝酸盐浓度比较（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

与PCI 组手术前比较，*P＜0.05；与非PCI 组手术后比较，△P＜0.05。

表5 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后PKG 浓度比较（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表5 ACS 患者PCI 组和非PCI 组手术前后PKG 浓度比较（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

与PCI 组手术前比较，*P＜0.05；与非PCI 组手术后比较，△P＜0.05。

图1 PCI 组术前PKG 与术后FMD 的相关性Fig.1 Correlation between preoperative PKG and postoperative FMD in PCI group

3 讨论

研究发现，ACS 患者冠状动脉存在内皮依赖性血管舒张功能异常，此功能异常同时累及周围动脉，外周动脉和冠状动脉血管反应一致[8]，肱动脉的内皮功能变化能间接反映冠状动脉的内皮功能情况。FMD 检测是目前常用的无创内皮功能检测方法之一，其主要作用介质是内皮细胞衍生的NO，利用无创高分辨率超声技术评估外周血管内皮依赖性舒张反应，可间接反映冠状动脉内皮功能。冠脉支架植入可造成急性冠脉内皮损伤，有时可合并动脉夹层或血肿。正常情况下，血管内皮细胞通过分泌前列环素和一氧化氮来防止血小板粘附、聚集和活化，并维持促凝（组织因子）、抗凝（肝素、蛋白C/S）和血栓溶解因子（组织纤溶酶原激活剂）之间的平衡。当血管内皮受损或功能失调时，其抗血小板功能减弱，促凝血活性增强；同时伴随血管收缩，局部血流减少，这些因素可增加支架血栓形成的风险[3]。本研究观察到ACS 患者中，PCI 组术后FMD 值较术前显著降低，而非PCI 组无明显变化；术后FMD 值PCI 组较非PCI 组显著降低，提示PCI 术后血管内皮功能受损。PCI 组术后血管内皮舒张功能受损，可能与以下因素有关：（1）PCI 术后引起的IR 可直接导致冠状动脉血管内皮损伤：正常状态下，内皮细胞通过合成和释放多种生物活性物质维持血管功能完整性，但在IR 诱导下血管内皮损伤严重，导致冠状动脉血管张力调节机能受损，加速冠状动脉血管壁重塑、促进血小板活化和聚集等，加重心肌IR 损伤[9-10]；（2）手术过程中的机械损伤：PCI行支架植入术前先进行经皮冠状动脉腔内血管成形术，球囊对狭窄/闭塞的冠状动脉进行机械性扩张及其引起的短暂性缺血，导致冠状动脉血管内皮细胞损伤；（3）损伤后再生的内皮细胞存在功能异常：手术机械操作造成内皮细胞的损伤或剥脱后，邻近细胞可出现内皮再生，但损伤后再生的内皮细胞存在内皮依赖性血管舒张能力的降低[3，11]。

研究表明，在血管内皮和心肌中表达的eNOS能够维持心脏和血管的正常生理功能，通过eNOS产生的NO 对缺血心肌具有保护作用[12-13]。eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信号通路介导内皮依赖的血管舒张，PKG 被认为是最重要的下游靶点[14]。PKG 在多种生理过程中发挥着核心作用，如调节血管平滑肌细胞的收缩和舒张、抗高血压、抗心肌肥大、抗动脉粥样硬化和抗血管损伤等[15-16]。本课题组前期研究发现灯盏花乙素可促进PKG，尤其是PKG-Iα 表达，从而减轻人心脏微血管内皮细胞IR 损伤[5]，提示PKG 很可能是血管内皮IR 损伤中的一种保护因素，促进其合成可能减轻IR 损伤。本研究观察到PCI 组术后血清eNOS、亚硝酸盐浓度（反映NO 量）和PKG 浓度均较非PCI 组显著降低，提示ACS 患者进行PCI 操作较单纯冠脉造影术明显降低了血清eNOS、NO、PKG 浓度。而组内比较发现，PCI 组患者术后血清eNOS、亚硝酸盐和PKG 浓度均较术前显著降低，而非PCI组术后亚硝酸盐浓度、PKG 浓度较术前均无明显下降，虽然非PCI 组eNOS 浓度术后较术前降低，但PCI 组术后降低更显著。PCI 组患者术前PKG浓度与术后FMD 具有正相关关系，提示PKG 可能对血管内皮功能具有保护作用，PKG 水平高则血管内皮损伤程度相对较轻。

ACS 患者进行PCI 治疗后，由于PCI 引起的IR 损伤及机械损伤等原因，使血管内皮功能受损；同时PCI 术后与内皮依赖的血管舒张相关因子eNOS、NO、PKG 浓度也较术前明显下降，提示ACS 患者PCI 术后血管内皮损伤可能与eNOS、NO及PKG 的降低有关，eNOS/NO/PKG 信号通路可能参与ACS 患者PCI 术后血管内皮保护作用。

本研究结果提示ACS 患者PCI 术可导致血管内皮功能的损伤，其可能与eNOS/NO/PKG 信号通路有关，上调PKG 信号通路可能是拮抗PCI 术后血管内皮损伤的治疗靶点。但PKG 信号通路在ACS 患者PCI 术后致血管内皮IR 损伤的具体作用机制，以及eNOS/NO/PKG 信号通路与血管内皮功能之间的因果关系，还需更大样本的临床和实验研究加以验证。