香椿叶提取物对高脂饮食小鼠视网膜损伤机制的影响△

杜益茗 曹长顺 石建峰 于利 姜双 刘华

脂代谢异常可对人体各器官产生不利影响，如粥样斑块形成、管壁增厚、血流动力学改变以及脂质沉积等。Shen等[1]研究发现，脂代谢异常与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病密切相关，它是脂代谢异常影响到眼部血液动力的结果。AMD患者的总胆固醇(totcal cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和甘油三酯(triglycerides,TG)显著升高，高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平显著降低[2-3]。流行病学调查发现,AMD与血脂异常有关,TC每增加1 mg·L-1，AMD的发病几率则增加16%，而HDL水平每增高0.2 mg·L-1，则减少10%的AMD发病率[4]。同时，脂代谢异常也可以导致视网膜形态的改变，包括视网膜色素上皮(RPE)细胞的形态损害、Bruch膜脂质的沉着破坏、脉络膜毛细血管内皮细胞的病理改变[5]。

香椿叶提取物(toona sinensis leaves extract，TSLE)是从原产于亚洲地区的红木衫属中国香椿树中提取而来。TSLE现在已经被用于治疗肠炎、痢疾、痈等疾病，同时TSLE可以降低血压和血糖来预防冠状动脉疾病和糖尿病的发生[6-7]。近年来研究发现，TSLE可在降低高脂动物模型血清中TG、TC和LDL水平的同时还具有增高HDL的趋势[8]，此外，其抗炎、抗氧化、抗衰老等作用也可能对脂代谢异常所引起的视网膜组织氧化应激损伤、细胞衰老凋亡起到较好的保护作用。因此，本研究选取TSLE对高脂饮食所致的小鼠视网膜组织损伤机制的保护作用进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物模型的建立与分组40只6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：正常对照组(NC组)、高脂组(HF组)、低剂量TSLE用药组(L-TSLE组)以及高剂量TSLE用药组(H-TSLE组)，每组各10只。所有小鼠自由进食和饮水，在室温18～23 ℃、湿度50%～65%、12 h/12 h昼夜交替的环境中饲养。

1.1.2 主要试剂与仪器苏木素、伊红(北京百奥莱薄科技有限公司)；STAT3、P-STAT3、JAK2、P-JAK2(美国Abcam公司)；DAPI、CL488(美伦生物科技有限公司)；复方托吡卡胺滴眼液(参天制药株式社会)；甲基纤维素(迈联生物有限公司)；无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)；二甲苯、PRIAl裂解液(天津市科密欧化学试剂有限公司)；SD-PAGE凝胶试剂盒、BCA定量试剂盒(上海碧云天生物公司)。小鼠眼底成像系统Ⅳ、小鼠视网膜电生理仪(美国Phoenix公司)；荧光显微镜、全自动脱水机、光学显微镜(德国徕卡公司)；Western blot电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 高脂模型小鼠的建立与给药方式NC组给予正常饮食，其他三组小鼠使用高脂饲料(体积分数30%脂肪；体积分数5%胆固醇；20 g·L-1胆酸钠；10 g·L-1丙硫脲嘧啶；620 g·L-1碳水化合物)以10 mL·kg-1·d-1的标准进行灌胃造模，持续28周。在24 周时，对L-TSLE组以及H-TSLE组给予香椿叶提取物(100 g·L-1)进行干预，L-TSLE组给药方式为50 mg·kg-1·d-1，H-TSLE组给药方式为100 mg·kg-1·d-1，NC组与HF组24周时给予等量生理盐水。在第28周高脂饮食结束后，使用10 g·L-1的戊巴比妥对四组小鼠进行麻醉，进行各项检查与检测。

1.2.2 视网膜电图检查各组小鼠(每组4只4眼)麻醉后进行散瞳。根据全视野视网膜电图(ERG)模块(Phoenix公司)获取小鼠ERG图像及数据并进行统计学分析。在操作开始时及结束后分别使用甲基纤维素保护角膜，防止角膜水肿，形成瘢痕。

1.2.3 血脂四项检测在第28周高脂饮食结束后，小鼠禁食8 h，采用心脏取血的方式对小鼠(每组5只)进行采血。以每秒3000转的离心速度对血液样品进行20 min离心，吸取血清用以检测。使用全自动生化分析仪检测血脂四项(TC、TG、HDL-C、LDL-C)。

1.2.4 HE染色麻醉并处死各组小鼠(每组4只4眼)，取眼球置入40 g·L-1多聚甲醛中固定 72 h。常规脱水包埋，5 μm 组织切片，经脱蜡至水后进行苏木素染色10 min，盐酸乙醇溶液返蓝15 s，水洗40 min后进行伊红染色10 min，再次水洗20 min后进行脱水至蜡，最后使用中性树胶进行封片，显微镜下观察视网膜各层结构情况。

1.2.5 免疫荧光组织化学染色检查组织切片经脱蜡至水后PBST浸洗3次，每次5 min，随后进行抗原修复，PBST浸洗3次，每次5 min，滴加体积分数10%山羊血清，30 min后滴加一抗(P-STAT3 1100,JAK2 1200)在4 ℃冰箱中过夜。第2天恢复室温30 min后PBST浸洗3次，每次5 min，滴加荧光标记的二抗37 ℃ 30 min，PBST浸洗3次，每次5 min。DAPI染色5 s后PBST浸洗3次每次5 min。最后封片观察。

1.2.6 Western blot检测麻醉并处死各组小鼠(每组6只12眼)，取下小鼠视网膜组织，向分离的各组小鼠视网膜组织中加入RIPA裂解液和适量蛋白酶抑制剂PMSF提取总蛋白，根据BCA蛋白定量方法测定蛋白浓度。在100 g·L-1的SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶上电泳分离总蛋白，并将其转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，将印迹封闭后与一抗在4 ℃下孵育过夜。第2天洗涤，进一步在室温下二抗孵育，使用底物化学发光ECL法显影。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 各组小鼠视网膜电图检查结果比较四组小鼠视网膜a波、b波振幅比较，在闪光强度为3.8 log·cd·s·m-2时，HF组较NC组a波、b波振幅均明显减弱，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；L-TSLE组及H-TSLE组与HF组相比，a波、b波振幅均有所增强，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，且幅度变化具有剂量相关性。见图1。

图1 各组小鼠视网膜电图检查结果 与NC组比较，*P<0.05；与HF组比较，**P<0.05

2.2 各组小鼠血清中TG、TC、LDL-C及 HDL-C的含量比较四组小鼠血清中TG、TC、LDL-C及 HDL-C含量检测结果显示，HF组与NC组相较，TC、TG、LDL-C含量均明显上升，HDL-C含量有所下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相较于HF组，L-TSLE组及H-TSLE组中TG、TC、LDL-C含量均明显下降，HDL-C均有所上升，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清中TG、TC、LDL-C及 HDL-C的含量比较

2.3 各组小鼠视网膜HE染色结果HE染色结果显示，NC组细胞排列整齐、规则；HF组内核层、外核层细胞排列不规则，RPE层结构紊乱；L-TSLE组及H-TSLE组与HF组比较，内核层细胞排列和数量以及RPE层结构均有所改善，其中以H-TSLE组细胞排列和结构显示效果最佳。见图2。

图2 各组小鼠视网膜HE染色结果 GCL：神经节细胞层；INL：核内层；ONL：外核层；箭头示RPE层(×400)

2.4 各组小鼠视网膜JAK/STAT通路免疫荧光组织化学染色与Western blot检查结果免疫荧光组织化学染色结果表明，DAPI染色表达于内核层与外核层。P-JAK2表达于细胞浆中，主要定位于视网膜神经纤维层的细胞浆中，少量定位于外核层。P-STAT3表达于细胞浆和细胞核中，主要定位于视网膜神经纤维层的细胞浆和细胞核中，少量定位于外核层和内核层。见图3。

图3 各组小鼠视网膜JAK/STAT通路免疫荧光组织化学染色检查结果 GCL：神经节细胞层；INL：核内层；ONL：外核层

Western blot检测结果表明，L-TSLE组及H-TSLE组与HF组相比，P-JAK2和P-STAT3蛋白表达量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，且H-TSLE组P-JAK2和P-STAT3蛋白表达量均较L-TSLE组蛋白表达水平更低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图4。

图4 各组小鼠视网膜中P-JAK2、P-STAT3蛋白表达量 A：各组小鼠视网膜P-JAK2蛋白检测条带；B：各组小鼠视网膜P-JAK2蛋白相对表达量；C：各组小鼠视网膜P-STAT3蛋白检测条带；D：各组小鼠视网膜P-STAT3蛋白相对表达量。与HF组比较，*P<0.05

3 讨论

高脂血症是指HDL-C、LDL-C、TG、TC四项指标出现异常。研究发现，其异常状态与粥样斑块、AMD、老年痴呆等密切相关[9-10]。多项研究表明，TSLE可诱导对人骨肉瘤细胞以及人肺癌细胞的抗增殖作用[11-12]。同时TSLE可上调PPARα的活化和PPARα的介导通过DNA改善脂质代谢异常。本研究我们发现，HF组小鼠出现了血脂生物标志的异常表现，这表明经28周高脂饮食的小鼠出现了脂代谢的异常，并且证实了TSLE可调节小鼠脂代谢异常引起的高脂血症。在早年的报道中发现，高脂血症可能是AMD的病因之一[13]。AMD导致的失明越来越受到关注，为此我们对这项研究做了进一步深入的讨论。

在脊椎动物的视网膜内高度富集长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，它主要维持细胞的功能和结构，同时它还为视色素和视紫红质的正常功能提供精确的微环境[14-15]。在光感受器基质(IPM)中的脂蛋白颗粒可通过在卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)、磷脂转移蛋白(PLTP)和胆固醇转移蛋白(CETP)的帮助下摄取额外的脂质而成熟，使它们被光感受器上的清道夫受体摄取。因此，IPM中的脂蛋白，尤其是HDL，不仅在胆固醇逆向转运中发挥作用，同时也作为RPE和光感受器之间穿梭服务的高度不溶性脂质分子存在[16]。 光感受器的代谢依赖于正常的RPE功能，而脂质代谢异常可能影响RPE和光感受器中的胆固醇平衡[17-18]。Bruch膜在调节视网膜和脉络膜毛细血管之间的营养、氧气、液体和代谢废物的传递方面发挥着重要作用[19]。Bruch膜中脂质的沉积会使Bruch膜增厚，增加Bruch膜中的疏水性，影响视网膜的代谢[20]。Barathi等[21]在高脂模型动物中发现，脂质积累可导致玻璃膜疣的沉积以及Bruch膜的明显增厚。而在我们的研究中，HF组小鼠经视网膜电图检测发现了a波及b波的振幅减小。TSLE组小鼠a波及b波明显呈上升趋势，且与药物剂量具有相关性。这表明，脂质损伤可引起视网膜的功能减退，尤其是视锥细胞、视杆细胞和双极细胞。我们发现，HF组小鼠视网膜中的内核层细胞排列紊乱，RPE层离断和紊乱，以及RPE、Bruch、脉络膜的增厚。这都说明本研究中的视网膜损伤模型是成功的，且这是由脂代谢异常导致的早期AMD小鼠模型。

在调节脂代谢的信号通路中，Janus激酶-信号转导和转录因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT)信号通路是脂质代谢的基本调节剂，该通路将信号从细胞外受体传输到细胞核控制脂质的代谢和催化[22]。相关研究表明，JAK/STAT信号通路存在于多器官中，在脑、肝、免疫系统等的调节中起关键作用，以及在肥胖和代谢疾病的情况下导致失调[23-25]。脂质的代谢可由VEGF、LEPR、SOCS3等细胞因子和激素通过激活JAK/STAT信号通路进而影响到标靶器官[26-28]。同时,脂代谢引起的氧化损伤可使视网膜中的JAK/STAT通路激活，P-JAK2/P-STAT3的活化可在神经节细胞层、内丛状层、RPE及脉络膜中出现[29-30]。本研究选取了JAK2/STAT3信号通路探讨TSLE对脂代谢异常引起的小鼠视网膜损伤的作用机制。我们对小鼠视网膜进行了免疫荧光组织化学染色分析和Western blot检测，结果表明，相较于NC组，HF组小鼠视网膜中P-JAK2、P-STAT3表达上调，相较于HF组，TSLE组小鼠视网膜中P-JAK2、P-STAT3表达下调。这提示TSLE是通过抑制JAK2和STAT3信号起到保护视网膜作用的。

综上所述，我们发现了TSLE通过介导JAK2/STAT3信号通路延缓脂代谢异常造成的小鼠视网膜损伤。因此我们认为TSLE具有治疗早期AMD的能力并可作为AMD治疗具有潜力的有效药物。