木犀草素对人脉络膜黑色素瘤细胞株C918血管生成拟态形成的影响

史梦琳 吴玮琪 罗昊 余进海 廖洪斐

脉络膜黑色素瘤是成年人眼内最常见的原发性恶性肿瘤，该肿瘤早期症状不明显，易漏诊、误诊，且恶性程度高、易全身转移，严重危及患者生命[1]。Maniotis等[2]发现，人葡萄膜恶性黑色素瘤中存在除肿瘤血管生成这一经典途径以外的肿瘤血供方式——血管生成拟态，即具有侵袭性的葡萄膜黑色素瘤细胞可以在无血管内皮细胞参与的情况下，通过自身变形和基质重塑形成由细胞外基质界定的微循环血供管道，促进肿瘤生长和转移[3]。因此，仅针对内皮细胞的抗血管生成药物，往往对存在血管生成拟态的肿瘤治疗效果不佳，寻找抑制血管生成拟态形成的药物，对肿瘤的治疗具有重要意义。

木犀草素又名黄色黄素、黄示灵，化学名为3’，4’，5，7-四羟基黄酮，为天然黄酮类化合物。既往大量研究表明，木犀草素具有抗炎、保护心血管、抗肿瘤等多种药理作用[4-6]。近期又有研究显示，在胃癌中，木犀草素通过Notch1-血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路抑制肿瘤的血管生成和血管生成拟态形成[7]；在小鼠皮肤黑色素瘤模型中，木犀草素可以降低黑素瘤血管生成拟态相关标志物(VEGF受体1、VEFG受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9)的表达水平，有效抑制了血管生成拟态的形成[8]。然而，木犀草素是否对脉络膜黑色素瘤具有抗血管生成拟态作用，尚未见相关报道。本研究拟对人脉络膜黑色素瘤细胞株C918进行体外三维培养，初步探讨木犀草素对C918细胞血管生成拟态形成的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料木犀草素(批号：MUST-18102605，HPLC≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司；人脉络膜黑色素瘤细胞株C918购自深圳豪地华拓生物技术有限公司，经STR鉴定合格；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)为以色列BI血清；RPMI 1640培养基、PBS均购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉素均购自武汉博士德生物科技有限公司；二甲基亚砜购自瑞士Roche公司；CCK-8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Matrigel购自美国Corning公司；糖原PAS染色液(细胞专用)购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SDS裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂混合物、蛋白磷酸酶抑制剂混合物购自北京普利莱基因技术有限公司；p-PI3K、AKT、p-AKT抗体均购自美国CST公司；GAPDH抗体购自美国Proteintech公司；PVDF膜购自美国Promega公司；ECL免疫印迹(Western blot)检测试剂盒购自美国Advansta公司。

1.2 细胞培养C918细胞使用RPMI 1640完全培养基(含体积分数10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素)，置于37 ℃、含体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 d 以18传代1次。

1.3 药物配制及实验分组木犀草素用DMSO溶解成100.00 mmol·L-1的母液，放于-20 ℃备用。实验时用RPMI 1640完全培养基稀释木犀草素母液至相应浓度。实验分为对照组(木犀草素0 μmol·L-1组)、木犀草素12.50 μmol·L-1组、木犀草素25.00 μmol·L-1组、木犀草素50.00 μmol·L-1组。

1.4 CCK-8法检测细胞活力消化并重悬处于对数生长期的C918细胞，以每孔10×103个接种于96孔板，置于细胞培养箱中过夜贴壁，弃培养基，PBS浸洗2次，分别加入含木犀草素0 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、6.25 μmol·L-1、12.50 μmol·L-1、25.00 μmol·L-1、50.00 μmol·L-1、100.00 μmol·L-1、200.00 μmol·L-1、400.00 μmol·L-1的培养基100 μL，每组均设置3个复孔。培养12 h、24 h后各孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续置于细胞培养箱中孵育1.5 h，然后用酶联免疫检测仪测定450 nm波长处的光密度值(D值)，通过GraphPad Prism软件拟合量效曲线。

1.5 细胞划痕实验C918细胞接种于6 cm培养皿，当细胞融合度达到95%以上时，用含体积分数0.1%FBS培养基饥饿培养3 h，用细胞刮比着直尺在培养皿中划痕，划痕宽度约120 μm，PBS浸洗2遍后，分组处理细胞，更换为含体积分数0.1%FBS的培养基，显微镜下拍照后置于细胞培养箱中继续培养5 h，再次显微镜下拍照，计算各组细胞的迁移速率。

1.6 Transwell侵袭实验实验前1 d，将Matrigel从-20 ℃取出放在冰盒里，于4 ℃冰箱中过夜融化。融化后的Matrigel用4 ℃预冷的RPMI 1640培养基行13稀释。用镊子将Transwell小室夹放于24孔细胞培养板中，取60 μL稀释后的Matrigel沿着Transwell小室侧壁缓慢滴加避免气泡产生，置于细胞培养箱中6 h以凝胶。分组处理细胞后以相同密度将150 μL细胞悬液加入上室，下室加入600 μL含体积分数20%FBS的RPMI 1640完全培养基。细胞培养箱中培养5 h后取出小室，轻轻甩干小室中的培养液，用细胞固定液固定C918细胞30 min，再用棉签擦去Transwell小室上层未穿膜的细胞，2 g·L-1结晶紫溶液染色5 min，PBS清洗数次，晾干，放于载玻片上，显微镜下拍照并计数各组穿膜细胞数。

1.7 C918细胞体外三维培养及糖原PAS染色将预先4 ℃过夜融化的Matrigel以每孔60 μL加入到96孔板，置于细胞培养箱中凝固2 h。消化处于对数生长期的C918细胞，分组处理后调整细胞密度为500×103个·mL-1，然后沿着孔壁慢慢加入200 μL细胞悬液，细胞培养箱培养5 h后显微镜下观察成管情况并拍照计数。

将上述培养5 h后的细胞行糖原PAS染色。轻轻甩去96孔板中的培养液，PAS固定液固定15 min；水洗2次，加入氧化剂，室温氧化15 min；水洗2次，加入Schiff Reagent，置于暗处浸染15 min；亚硫酸钠滴洗2次，每次2 min；水洗2次，加入Mayer苏木素染色液复染1 min；水洗，显微镜下计数环状结构数。

1.8 Western blot检测血管生成拟态相关蛋白的表达收集木犀草素处理5 h后的各组C918细胞，用含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的SDS裂解液裂解抽提细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。制备80 g·L-1SDS-PAGE胶，每孔加入30 μg蛋白质样品。调节电压为80 V，当样品通过浓缩胶进入分离胶界面时，电压调为110 V，直至溴酚蓝于胶底部结束电泳；湿法电转2 h；50 g·L-1BSA封闭液封闭1 h；分别加入兔抗人p-PI3K P85抗体(11000)、兔抗人AKT抗体(11000)、兔抗人p-AKT抗体(11000)、鼠抗人GAPDH抗体(15000)；摇床4 ℃孵育过夜；TBST漂洗4次，每次10 min；加入相应二抗(15000)，摇床常温孵育1 h；TBST漂洗4次，每次10 min；滴加ECL发光液，用成像系统显影。

1.9 统计学方法采用Excel及GraphPad Prism软件对实验数据进行处理分析。两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 木犀草素对C918细胞活力的影响CCK-8实验结果显示，木犀草素以剂量依赖性和时间依赖性抑制C918细胞活力。通过GraphPad Prism软件拟合量效曲线，确定木犀草素作用C918细胞12 h、24 h后，其IC50值分别为163.70 μmol·L-1和51.46 μmol·L-1。由此，预设0～50.00 μmol·L-1作为后续迁移、侵袭、血管生成拟态实验的药物浓度分组范围。见图1。

图1 不同浓度木犀草素对C918细胞活力的影响 A：木犀草素作用C918细胞12 h；B:木犀草素作用C918细胞24 h

2.2 木犀草素抑制C918细胞迁移细胞划痕实验结果显示，对照组、木犀草素12.50 μmol·L-1组、木犀草素25.00 μmol·L-1组、木犀草素50.00 μmol·L-1组C918细胞的迁移速率分别为(24.89±0.46)μm·h-1、(9.87±1.24) μm·h-1、(9.11±0.85) μm·h-1、(6.41±0.92)μm·h-1。各浓度木犀草素组细胞迁移速率均明显低于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)；木犀草素12.50 μmol·L-1组、木犀草素25.00 μmol·L-1组与木犀草素 50.00 μmol·L-1相比，细胞迁移速率差异均有统计学意义(均为P<0.05)；木犀草素12.50 μmol·L-1组与木犀草素25.00 μmol·L-1组相比，细胞迁移速率差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果说明，木犀草素有抑制C918细胞迁移的作用，且木犀草素50.00 μmol·L-1组作用效果最明显。见图2。

图2 各组细胞划痕实验结果(×100)

2.3 木犀草素抑制C918细胞侵袭Transwell细胞侵袭实验检测结果显示，对照组、木犀草素12.50 μmol·L-1组、木犀草素25.00 μmol·L-1组、木犀草素50.00 μmol·L-1组的C918细胞穿过上室的每200倍视野细胞数分别为(69±8)个、(14±4)个、(6±3)个和(3±1)个。各浓度木犀草素组与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.001)；木犀草素12.50 μmol·L-1组与木犀草素25.00 μmol·L-1组、木犀草素50.00 μmol·L-1组相比，细胞侵袭能力差异均有统计学意义(均为P<0.05)；木犀草素25.00 μmol·L-1组与木犀草素50.00 μmol·L-1组相比，细胞侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果说明木犀草素能抑制C918细胞侵袭。见图3。

图3 各组Transwell侵袭实验结果 A：对照组；B：木犀草素12.50 μmol·L-1组；C：木犀草素25.00 μmol·L-1组；D：木犀草素50.00 μmol·L-1组(×200)

2.4 木犀草素减少C918细胞血管生成拟态的形成显微镜下可见，对照组和木犀草素12.50 μmol·L-1组的C918细胞黏附于Matrigel表面，并自身变形、彼此连接，围成网格样、环状结构，对照组糖原PAS染色呈阳性，提示环状结构是由脉络膜黑色素瘤细胞构成，即血管生成拟态形成。对照组和木犀草素12.50 μmol·L-1组形成的环状结构数分别为每孔(87±4)个和(77±6)个，两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。而木犀草素25.00 μmol·L-1组和木犀草素50.00 μmol·L-1组仅有部分细胞形成树枝样结构，而无明显环状结构形成，说明当木犀草素浓度大于25.00 μmol·L-1时，C918细胞株血管生成拟态形成受到抑制。见图4。

图4 显微镜下观察各组C918细胞血管生成拟态 A：对照组，形成网格样、环状结构(×100),行PAS染色呈阳性(×400)； B：木犀草素12.50 μmol·L-1组，形成了网格样、环状结构(×100)； C、D：木犀草素25.00 μmol·L-1组和木犀草素50.00 μmol·L-1组，仅有部分细胞形成树枝样结构，无明显环状结构形成(×100)

2.5 木犀草素对C918细胞各蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，对照组、木犀草素12.50 μmol·L-1组、木犀草素25.00 μmol·L-1组、木犀草素50.00 μmol·L-1组各蛋白相对表达量间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。随着木犀草素浓度增高，p-PI3K P85、p-AKT蛋白表达下调，AKT蛋白表达不变，p-AKT与AKT比值减小。见图5。

图5 Western blot检测各组C918细胞血管生成拟态相关蛋白的表达 1:对照组;2:木犀草素12.50 μmol·L-1组;3:木犀草素25.00 μmol·L-1组;4:木犀草素50.00 μmol·L-1组。与对照组相比，*P<0.05；与木犀草素12.50 μmol·L-1组相比，#P<0.05；与木犀草素25.00 μmol·L-1组相比，△P<0.05

3 讨论

脉络膜黑色素瘤是眼内常见的原发性恶性肿瘤，其恶性程度高、转移快[1]。导致脉络膜黑色素瘤患者死亡的最主要原因是肿瘤浸润、转移，而肿瘤血管生成是其浸润、转移的重要一环[9]。传统抗肿瘤血管生成的药物主要是针对内皮细胞的血管生成，而对抑制肿瘤细胞自身血管生成拟态效果不佳。在具有血管生成拟态的实体肿瘤中，抗内皮细胞血管生成治疗所导致的低氧环境反而可能促进血管生成拟态的形成，促进肿瘤的转移[10]。

血管生成拟态是指肿瘤细胞通过自身变形并与细胞外基质相互作用形成管道结构，此管道结构具有“内皮细胞”和“肿瘤细胞”的双重特性，给肿瘤供血，促进肿瘤生长、转移。目前，在多种恶性实体肿瘤中发现了血管生成拟态现象的存在，血管生成拟态的管壁呈PAS染色阳性，而内皮细胞标志物，如CD34染色则呈阴性，因此PAS-CD34双染常作为体外血管生成拟态的检测方法。除此以外，肿瘤细胞与Matrigel或Ⅰ型鼠尾胶原蛋白等细胞外基质成分所构建的三维体外培养模型也常作为体外血管生成拟态的检测方法，如果肿瘤细胞在Matrigel或Ⅰ型鼠尾胶原蛋白中形成网状分支，则提示血管生成拟态的形成[11-12]。另外，还有报道显示，X射线显微断层摄影3D重建方法对是否有血管生成拟态形成也有提示作用[13]。

本研究发现，木犀草素对C918细胞活力的抑制具有剂量依赖性和时间依赖性，考虑到木犀草素浓度过高可能诱导细胞凋亡或坏死，因此，根据12 h和24 h的IC50值，确定0～50.00 μmol·L-1木犀草素作为后续迁移、侵袭、血管生成拟态实验的药物浓度范围。

肿瘤细胞对细胞外基质的降解和迁移、侵袭是血管生成拟态形成的重要环节。本研究我们发现，木犀草素能显著抑制人脉络膜黑色素瘤细胞株C918的迁移和侵袭。运用Matrigel所构建的三维培养C918细胞模型中，观察到C918细胞能在体外形成血管生成拟态，而高于25.00 μmol·L-1木犀草素对血管生成拟态的形成有明显抑制作用。Western blot检测结果显示，木犀草素会抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路磷酸化。PI3K/AKT信号通路广泛存在于细胞增殖、凋亡和分化等多种生命活动中，是近年来发现的重要细胞内中心信号转导通路之一。有研究表明，CXCL8通过PI3K/AKT信号通路抑制人脑胶质瘤细胞株 U87MG 和 U251血管生成拟态形成；EGFR通过PI3K/AKT信号通路抑制人胶质瘤SHG-44细胞血管生成拟态形成[14-15]。还有研究发现，姜黄素是通过PI3K抑制脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1血管生成拟态形成，且推测PI3K为脉络膜黑色素瘤血管生成拟态形成通路中信号转导的中枢分子[12]。由此我们推测，PI3K/AKT信号通路在木犀草素抑制的人脉络膜黑色素瘤细胞株C918血管生成拟态中可能也起到关键性的调控作用。

综上，本研究为肿瘤抗血管生成治疗提供新的思路，同时也存在不足，此次研究我们未进行PI3K/AKT通路中明星分子的回复实验；且仅进行了木犀草素对C918细胞的体外实验，而木犀草素是否在其他存在血管生成拟态的肿瘤细胞株和相关动物模型中也有抑制血管生成拟态作用，尚需进一步研究。