miR-1908抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞系HRECs凋亡

周丽萍，毛晓春，李 琴

(襄阳市中心医院 眼科， 湖北 襄阳 441000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的主要并发症之一，严重时可导致失明，极大地影响患者身心健康[1]。目前，DR的发病机制尚不十分清楚，并且无确切有效的治疗方法，探讨DR的发病机制并寻找安全有效的治疗方法具有重要意义。高血糖能够加速细胞凋亡引起视网膜缺血、坏死，新生血管释放产生新生血管[2]。DR与高血糖引起的生理、生化改变造成的毛细血管损伤有关[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为22～25个核苷酸的小分子单链RNA，其与血管性疾病、新生血管的形成等关系密切[4-6]。微小RNA芯片检测发现高糖环境下人视网膜血管内皮细胞(human retinalendothelial cells，HRECs)中miR-1908表达下调[7]，但miR-1908对高糖诱导的HRECs细胞凋亡的影响及其机制还不清楚。本研究主要探讨了miR-1908对高糖诱导的HRECs细胞凋亡的影响及作用机制，以期为阐明DR发病机制及分子治疗靶点的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂

人视网膜血管内皮细胞系(human retinalendothelial cells，HRECs)(ATCC细胞库)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培养基( Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogen公司)；miR-1908模拟物(mimics)及模拟阴性对照物、整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的小干扰RNA(基尔顿生物科技上海有限公司)；Trizol试剂(Tiangen公司)；反转录试剂盒和PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；PAGE膜(Bio-RAD公司)；ILK抗体(Santa Cruz公司)；B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase，GAPDH)抗体(CST公司)；辣根过氧化酶标记的IgG(北京中山生物技术有限公司)；ECL化学发光试剂(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：复苏HRECs细胞，加入含10% FBS的DMEM培养基(含5.5 mmol/L葡萄糖)，置于37 ℃、5% CO2、97%湿度的培养箱中培养。根据细胞增殖状况，每2～3 d换液1次。待细胞汇合至80%～90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。取对数增殖期的5～10代细胞用于实验。参照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明，分别将miR-1908 mimics(miR-1908组)、模拟阴性对照物(miR-NC组)、miR-1908 抑制剂(anti-miR-1908组)、抑制剂阴性对照(anti-NC组)、ILK的小干扰RNA(si-ILK组)、乱序无意义阴性序列(si-NC组)、miR-1908 mimics与ILK过表达载体(miR-1908 +pcDNA3.1-ILK)、miR-1908 mimics与空载体(miR-1908 +pcDNA3.1组)转染至HRECs细胞。将HRECs细胞分为8组：1)对照组：正常培养(5.5 mmol/L葡萄糖)；2)高糖组：25 mmol/L[8]葡萄糖干预HRECs细胞；3)高糖+ miR-NC组：25 mmol/L葡萄糖干预miR-NC组细胞24 h；4)高糖+ miR-1908组：25 mmol/L葡萄糖干预转染miR-1908组细胞24 h；5)高糖+ si-NC组：25 mmol/L葡萄糖干预 si-NC组24 h；6)高糖+ si-ILK组：25 mmol/L葡萄糖干预si-ILK组细胞24 h；7)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1组：25 mmol/L葡萄糖干预miR-1908+pcDNA3.1组细胞24 h；8)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK组：25 mmol/L葡萄糖干预miR-1908+pcDNA3.1-ILK组细胞24 h。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-1908表达水平：使用Trizol试剂提取HRECs细胞中总RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。参照反转录试剂盒操作说明，将RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-1908的相对表达水平。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡：各组HRECs细胞培养后用胰蛋白酶消化，PBS溶液清洗后，加入100 μL缓冲液，轻轻吹打重悬细胞。然后加入10 μL的Annexin-V-FITC，室温避光孵育20 min。再加入5 μL的PI，混合均匀，室温避光孵育15 min。最后加入500 μL缓冲液，用流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：使用RIPA裂解液提取细胞中总蛋白，置于冰上充分裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液即为蛋白。BCA法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，分离后转移至PAGE膜，使用5 %脱脂牛奶室温封闭2 h后，分别加入ILK(稀释度1∶150)、Bcl-2(稀释度1∶500)、Bax(稀释度1∶500)和GAPDH(稀释度1∶500)抗体，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的IgG，室温孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL化学发光试剂，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验：应用生物信息学软件预测ILK的3′UTR含有miR-1908的互补序列。用PCR扩增两者结合位点的片段，将该片段插入pMIR-REPORT荧光素酶载体中，构建ILK野生型质粒(WT-ILK)，并使用点突变技术对结合位点进行突变，构建 ILK突变型质粒(MUT-ILK)。将miR-NC与WT-ILK(miR-NC+WT-ILK组)、miR-1908与WT-ILK(miR-1908+WT-ILK组)、miR-NC与MUT-ILK(miR-NC+MUT-ILK组)、miR-1908与MUT-ILK(miR-1908+MUT-ILK组)共转染至HRECs细胞，转染48 h后，收集细胞，参照双荧光素酶报告基因试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-1908在高糖作用的HRECs细胞中的表达水平

与低糖组比，高糖组HRECs细胞中miR-1908的表达水平显著降低(图1)(P<0.05)。

*P<0.05 compared with LG group图1 高糖对HRECs细胞中 miR-1908表达的影响Fig 1 Effect of high glucose on the expression ofmiR-1908 in HRECs cells

2.2 过表达miR-1908对高糖作用的HRECs细胞凋亡的影响

与高糖+ miR-NC组比，高糖+ miR-1908组HRECs细胞中miR-1908表达水平和Bcl-2蛋白表达水平显著升高，HRECs细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低(图2，表1)(P<0.05)。

表1 过表达miR-1908对高糖作用的HRECs细胞凋亡率的影响

2.3 miR-1908靶向调控ILK表达

ILK的3′UTR含有miR-1908的互补序列(图3A)。miR-1908可降低ILK野生型3′UTR的荧光素酶活性(表2)(P<0.05)。与miR-NC组比，miR-1908组HRECs细胞中ILK蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比，anti-miR-1908组HRECs细胞中ILK蛋白表达水平显著升高(图3B，表3)(P<0.05)。

A.flow cytometry; B,C.effect of over-expression of microRNA-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG and miR-NC group

表2 双荧光素酶报告实验

A.ILK’s 3′UTR contained complementary sequences of miR-1908; B.miR-1908 regulated the expression of ILK图3 miR-1908靶向、调控ILKFig 3 miR-1908 targeted and regulated ILK

表3 miR-1908调控ILK的表达

2.4 抑制ILK表达对高糖作用的HRECs细胞凋亡的影响

与高糖+ si-NC组比，高糖+ si-ILK组HRECs细胞中ILK和Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(图4)(P<0.05)。

2.5 过表达ILK能逆转miR-1908对高糖作用的HRECs细胞凋亡的影响

与高糖+miR-1908+pcDNA3.1组比，高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK组HRECs细胞中ILK和Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(图5)(P<0.05)。

3 讨论

DR是糖尿病最常见的微血管并发症，高血糖是导致糖尿病并发症发生和发展的重要因素之一[9]。高血糖环境可引起细胞代谢发生变化，异常凋亡引起器官功能紊乱。目前，DR发生和发展的病理机制尚未十分清楚。探讨影响高糖诱导的HRECs细胞凋亡的分子机制，有助于阐明该疾病的发病机制，并寻找有效的治疗靶点。

miRNA参与细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等各种生物学行为，在疾病的发生和发展过程中发挥重要作用[10]。miR-1908在非小细胞肺癌细胞中低表达，过表达miR-1908可抑制其增殖，是非小细胞肺癌的治疗靶点[11]。miR-1908在胶质瘤组织中表达上调， 上调miR-1908表达促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力[12]，说明miR-1908在不同疾病中发挥的作用不同。目前，miR-1908对高糖诱导的HRECs细胞凋亡的影响还未见报道。本研究结果显示，高糖诱导可促进HRECs细胞miR-1908的表达，提示miR-1908可能参与糖尿病视网膜病变的发生和发展。本研究结果显示，过表达miR-1908能够降低高糖诱导的HRECs细胞凋亡率，并上调HRECs细胞中Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，提示miR-1908可能通过调控Bcl-2和Bax蛋白表达抑制高糖诱导的HRECs细胞凋亡，更详尽的调控机制有待深入探讨。

A,B.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic protein expression of hrecs induced by high glucose; C.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic rate of hrecs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG+si-NC group

A,B.over-expression of ILK can reverse miR-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; C.overe-xpression of ILK can reverse the apoptosis rate of HRECs induced by miR-1908; *P<0.05 compared with HG+miR-NC group; #P<0.05 compared with HG +miR-1908+pcDNA3.1 group

miRNA通过与靶mRNA互不配对在转录后水平调控靶基因的表达，参与各种疾病的发生和发展[13-14]。为了进一步探讨miR-1908影响高糖诱导的HRECs细胞凋亡的分子机制，本研究首先利用TargetScan生物信息学软件预测显示，整合素连接激酶(ILK)的3′UTR含有miR-1908的互补序列，提示miR-1908可能调控ILK表达。双荧光素酶报告基因结果证实了miR-1908可与ILK的3′UTR靶向结合。同时上调miR-1908表达HRECs细胞中ILK蛋白表达降低，而下调miR-1908表达HRECs细胞中ILK蛋白表达升高，进一步说明miR-1908靶向负调控ILK表达。

ILK是一种高度保守的蛋白，通过介导细胞与细胞外基质的跨膜信号传导，参与调节细胞增殖、凋亡和分化等生物学行为。作为一种多功能调节因子，ILK参与糖尿病视网膜病变的发生和发展[15]。本研究结果显示，抑制ILK可能通过上调HRECs细胞Bcl-2蛋白表达并下调Bax表达，抑制了高糖诱导的HRECs细胞凋亡。此外，过表达ILK部分逆转了过表达miR-1908对高糖诱导的HRECs细胞凋亡及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，提示miR-1908可能通过靶向负调控ILK表达，上调Bcl-2蛋白表达并下调Bax表达抑制高糖诱导的HRECs细胞凋亡，是DR疾病的潜在治疗靶点。

综上所述，miR-1908参与调控HRECs细胞凋亡，其作用机制可能与负调控ILK影响Bcl-2和Bax蛋白表达有关，是糖尿病视网膜病变治疗的潜在分子靶点。