非小细胞肺癌组织miR-25表达变化及其临床意义

秦维超，张琳

1 重庆市江津区中心医院，重庆402260；2 成都中医药大学附属医院

肺癌是世界范围内威胁人类健康的常见恶性肿瘤，根据病理类型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占80%～85%[1]。在临床上，大多数NSCLC患者就诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机，5年生存率往往不足15%[2]。因此，早发现、早治疗成为延长NSCLC患者生存期的关键。但是迄今为止，还没发现可靠的生物标志物早期预测NSCLC的发生、发展。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，能够通过与靶基因3′非编码区特异性结合使靶基因降解或翻译抑制，从而在转录后水平调节基因的表达[3，4]。近年研究发现，miRNA在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。miR-25是近年发现的肿瘤相关miRNA之一，属于miR-106b-25家族，定位于人7号染色体，可在多种肿瘤组织中表达上调，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的调控作用[5]。已有研究证实，miR-25能够参与肺癌的发生、发展，有可能成为肺癌早期诊断的分子生物标志物和潜在的药物治疗靶点[6]。但鲜见miR-25表达与NSCLC患者远期生存率关系的报道。本研究观察了NSCLC组织miR-25表达变化，并进一步分析其表达与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年5月～2014年5月重庆市江津区中心医院收治的NSCLC患者68例。所有患者经术后组织病理学检查明确诊断。纳入标准：①符合NSCLC诊断标准；②接受肺叶或全肺切除术、肺段或肺楔形切除术+系统性淋巴结清扫术，切缘均阴性；③术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；③合并哮喘、慢性阻塞性肺疾病等其他肺部疾病者。其中，男42例、女26例，年龄(54.2±15.7)岁(<50岁29例、≥50岁39例)；吸烟指数：<400年支26例，≥400年支42例；肿瘤直径：<3 cm 29例，≥3 cm 39例；病理类型：鳞癌43例，腺癌25例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期26例，Ⅲ期20例；病理分级：G1级28例，G2级30例，G3级10例；有淋巴结转移28例，无淋巴结转移40例。本研究经重庆市江津区中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 miR-25表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的NSCLC组织及其配对的癌旁组织(距肿瘤组织边缘>5 cm，且经组织病理学检查证实为正常肺组织)，液氮速冻后，转运至-80 ℃冰箱保存，待组织成批。实验前取NSCLC组织和癌旁正常组织各约30 g，液氮下研磨成粉，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA反转录为cDNA。反转录条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 10 min。以cDNA为模板，按照SYBRGreen Realtime PCR Master Mix说明进行PCR扩增。所有引物序列由北京华大基因研究中心有限公司设计合成。miR-25上游引物5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游引物5′-TGCTTAACCCCTCACCTTGA-3′；β-actin上游引物5′-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3′，下游引物5′-TGGTACGGCCAGAGGCG-3′。PCR反应体系共20 μL：2×PCR buffer 2 μL，Taq DNA聚合酶1 U，dNTPs 0.3 mmol/L，上下游引物各0.8 μmol/L，模板DNA 40 ng，用ddH2O补足至20 μL；反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、54 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min共35个循环，最后72 ℃ 10 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-25相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者术后定期门诊复查，术后2年内每3～6个月复查1次，术后2～5年每6个月复查1次，术后5年以上每年复查1次。随访截至2019年5月，统计患者生存情况。

2 结果

2.1 NSCLC组织与癌旁正常组织miR-25表达比较 NSCLC组织miR-25相对表达量为1.22±0.16，癌旁正常组织为0.48±0.08。NSCLC组织miR-25相对表达量高于癌旁正常组织(t=7.27，P<0.01)。

2.2 NSCLC组织miR-25表达与患者临床病理特征的关系 以NSCLC组织miR-25相对表达量的均数为临界值，将患者分为miR-25高表达者31例、miR-25低表达者37例。NSCLC组织miR-25表达与患者临床病理特征的关系见表1。

表1 NSCLC组织miR-25表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 不同miR-25表达者5年生存率比较 随访截至2019年5月，miR-25高表达者失访4例、死亡14例，5年生存率为51.6%；miR-25低表达者失访8例、死亡8例，5年生存率为78.4%。miR-25高表达者5年生存率低于miR-25低表达者(χ2=4.968，P<0.05)。见图1。

图1 不同miR-25表达者的生存曲线

2.4 影响NSCLC患者预后的危险因素分析 以NSCLC患者性别、年龄、吸烟指数、肿瘤直径、病理类型、TNM分期、病理分级、淋巴结转移和miR-25表达为自变量，随访截至日期患者生存状况为因变量，进行单因素Cox回归模型分析。结果显示，吸烟指数、病理类型、TNM分期、病理分级、淋巴结转移和miR-25表达可能与NSCLC患者预后有关(P均<0.05)，而性别、年龄、肿瘤直径与NSCLC患者预后无关(P均>0.05)。多因素Cox回归模型分析显示，吸烟指数、TNM分期、病理分级、淋巴结转移和miR-25表达是影响NSCLC患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。见表2、3。

表2 影响NSCLC患者预后的单因素Cox回归模型分析结果

表3 影响NSCLC患者预后的多因素Cox回归模型分析结果

3 讨论

近年来，随着环境污染加重、人口老龄化加剧，我国男性肺癌的发病率高居所有恶性肿瘤首位，女性肺癌的发病率仅次于乳腺癌，居第2位[7，8]。根据病理类型，可将肺癌分为小细胞肺癌和NSCLC，其中NSCLC占80%～85%[1]。大多数NSCLC患者就诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机，5年生存率往往不足15%[2]。因此，早发现、早治疗成为延长NSCLC患者生存期的关键。目前，临床常用的肺癌诊断方法有痰脱落细胞学检查、支气管镜检查、肺泡灌洗液检查、经皮穿刺肺活检等。但这些检查并不适合作为肺癌大规模的筛查手段。肿瘤标志物是反映体内肿瘤存在的一种化学类物质，广泛用于肿瘤的筛查、诊断和治疗。但迄今为止尚未发现可靠的生物标志物早期预测NSCLC的发生、发展。

miRNA在细胞生长、发育过程中发挥关键的调控作用[9]。近年越来越多研究发现，miRNA在多种恶性肿瘤中异常表达，可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展[10]。miRNA在外周血、组织、痰液、胸腔积液、肺泡灌洗液中均稳定表达且不易被降解，具有作为肿瘤标志物的潜能。miR-25是近年发现的肿瘤相关miRNA之一，属于miR-106b-25家族，定位于人7号染色体。有研究发现，miR-25能够促进视网膜母细胞瘤的恶性表型[11]；下调miR-25表达，能够抑制卵巢癌细胞生长和迁移[12]；miR-25能够通过靶向调控FBXW7、DKK3表达，促进胶质瘤细胞增殖和迁移[13]。有研究还发现，胃癌患者血清miR-25水平升高，血清miR-25可作为胃癌早期诊断和预后评估的生物标志物[14]。以上研究表明，miR-25能够参与多种恶性肿瘤的发生、发展。有研究发现，NSCLC患者血清miR-25水平明显升高，其水平越高，肿瘤恶性程度越高，患者预后越差[15]。但目前二者的关系缺乏大规模的临床研究。

本研究结果发现，NSCLC组织miR-25相对表达量高于癌旁正常组织，提示miR-25在NSCLC的发生、发展过程中可能发挥促癌基因作用。为进一步研究miR-25表达与NSCLC患者临床病理特征和预后的关系，以NSCLC组织miR-25相对表达量的均数为临界值，将NSCLC患者分为miR-25高表达者与低表达者。结果发现，miR-25高表达者吸烟指数、TNM分期和病理分级较高，淋巴结转移较多，进一步证实miR-25能够参与NSCLC的恶性进展。本研究miR-25高表达者5年生存率明显低于miR-25低表达者，提示miR-25表达与NSCLC患者预后有关，与以往报道[16，17]基本一致。本研究Cox回归模型分析显示，吸烟指数、TNM分期、病理分级、淋巴结转移和miR-25表达是影响NSCLC患者预后的独立危险因素。因此，miR-25能够作为判断NSCLC患者预后的血清生物学指标。

综上所述，NSCLC组织miR-25高表达，其高表达与肿瘤的发生、发展有关，并且其高表达是NSCLC患者预后不良的独立危险因素。