败酱多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究

尉捷 王丹 王育林

摘要  目的：优化败酱多糖提取工艺，并评价其体外抗氧化活性。方法：在单因素考察的基础上设计正交试验，以提取时间、提取温度、料液比为考察因素，以多糖提取率为考察指标，优化败酱多糖的提取工艺;采用比色法考察其抗氧化活性。结果：最佳条件为提取时间3 h，提取温度100 ℃，提取次数3次，料液比1∶ 25，多糖提取率为（3.42±0.27）%。多糖对1，1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）自由基具有较高的清除活性，对超氧阴离子和羟基的自由基清除作用相对不明显。结论：该方法稳定可靠，可用于提取具有较强抗DPPH活性的败酱多糖。

关键词  败酱;多糖;提取条件;抗氧化活性

Extraction Optimization and Antioxidant Activity Estimation for Polysaccharides from Patrinia

WEI Jie1，2，WANG Dan2，WANG Yulin1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Beijing City University，Beijing 100083，China）

Abstract Objective： To optimize the extraction process for polysaccharides from Patrinia and to estimate their in vitro antioxidant activity. Methods： An orthogonal experiment was designed on the basis of single factor investigation，extraction time，extraction temperature，material-to-liquid ratio was taken as investigation factors，polysaccharide extraction rate was taken as an investigation index，and the extraction process of polysaccharides from Patrinia was optimized; colorimetry was used to investigate its antioxidant activity. Results： The optimal conditions were determined to be 3 h for extraction time，100 ℃ for extraction temperature and 1：25 for solid-liquid ratio，the extraction rate was（3.42±0.27）%.Polysaccharides have high scavenging activity on 1，1-diphenyl-2-pyridine hydrazide（DPPH）free radicals，but relatively little scavenging activity on superoxide anion and hydroxyl radicals. Conclusion： This method is stable and reliable，and can be used to extract polysaccharides from Patrinia with strong anti-DPPH activity.

Keywords  Patrinia; Polysaccharides; Extraction condition; Antioxidant activity

中圖分类号：R284.1 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.002

败酱草，又名胭脂麻，为败酱科植物黄花败酱（ Patrinia scabiosaefolia  Fisch.ex Trev）、白花败酱（ Patrinia villosa  Juss）的带根全草，始载于《神农本草经》。辛、苦，微寒，归胃、大肠、肝经，具有清热解毒、祛瘀止痛等功效，可用于治疗肠痈、肺痈、燥热便秘等证[1]。

败酱中的化学成分主要有黄酮类、皂苷类、环烯醚萜类、挥发油和多糖类等，比较复杂多样[2]。其药理作用也非常广泛，有抑菌、抗病毒、抗炎、镇静、抗肿瘤作用等。孟良玉等从败酱中提取的黄酮类化合物，发现其具有较强的抗氧化活性，沈德凤等发现白花败酱总皂苷通过提高抗氧化能力发挥抗肿瘤作用[3-4]。

从药用植物中提取的多糖因其独特的生物活性，近年来受到了越来越多的关注[5-6]。植物多糖具有较强的抗氧化和调节免疫作用，可以通过体外作为自由基清除剂用于预防多糖的氧化损伤。然而，迄今为止还没有关于败酱多糖（PSP）的抗氧化性的研究报道。因此，本实验采用L9（3）4正交设计试验优化了败酱多糖的提取，并评价了败酱多糖的抗氧化活性，为中药败酱草的开发和败酱多糖的利用提供参考[7-8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 电子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型号：PL203）、干燥箱（上海力辰科技有限公司，型号：101-0BS）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-2010）、恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司，型号：HH-S26）、数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DB）、艾泽拉多功能粉碎机（浙江万基塑业有限公司，型号：2000c）、恒温恒湿箱（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂，型号：HSP-250B）、精密pH计（赛多利斯公司，德国，型号：PB-10）。

1.2 试剂 D-无水-葡萄糖（中国食品药品鉴定研究院，批号：11508-201602），1，1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：D1602005）

1.3 分析样品 败酱草于2016年5月采集于中国广西省玉林市，经北京城市学院李京生教授鉴定为败酱科植物黄花败酱 Patrinia scabiosaefolia  Fisch.ex Trev的干燥全草，粉碎后过40目筛后备用。

2 方法与结果

2.1 药材预处理 根据参考文献[7]进行药材预处理，简述如下：称取败酱黄花药材粉末1 000 g，用石油醚（60～90 ℃）脱脂后，加入95%乙醇提取3次，得到药渣约246 g。

2.2 败酱多糖含量测定

2.2.1 线性关系考察 采用苯酚-硫酸法，按参考文献进行操作[9]，葡萄糖做为对照品溶液，蒸馏水同法操作，作为空白对照，在波长492 nm下测吸光度值。以对照品葡萄糖浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y），进行回归，得方程为Y=0.015 6X-0.007 8（R2=0.998），在5～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 方法学考察 根据参考文献[7-9]进行方法学考察，可知仪器精密度良好，RSD为0.12%;方法重复性良好，RSD为2.07%;溶液在3 h内稳定，RSD为0.54%;方法准确度良好，平均加样回收率为97.63%，RSD为4.79%。

2.3 败酱多糖提取单因素试验

2.3.1 提取时间考察 取适量药渣（M1），精密称定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入1∶ 20的蒸馏水，于超声（40 kHz，200 W）提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，每組平行3次。所得液体过滤并减压浓缩至约10 mL，按照Savage法除蛋白[10]，减压干燥，得到精制多糖，精密称定其质量（M2），计算提取率（公式为：M2/M1×100%）。见图1。随着提取时间的增加，败酱多糖提取率逐渐增加，从1 h增加到3 h，提取率显著提高，提取时间为3 h达到最大值（3.46±0.10）%，而当提取时间超过3 h时，得率无明显增加，故选择2～3 h做进一步优化。

2.3.2 提取温度 取适量药渣，精密称定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入料液比为1：20的水，提取温度分别为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃，超声处理120 min（ n =3），按“2.3.1”项下方法核算败酱多糖提取率。见图2。由图2可知，当提取温度从60 ℃提高到100 ℃，提取率明显提高，在100 ℃时达到峰值（3.29±0.113）%;其中，提取温度在95～100 ℃范围内时，多糖产量没有明显增加，故选择80～100 ℃做下一步优化。

2.3.3 料液比 取适量药渣，精密称定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入蒸馏水，和物料的比例分别为1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30的蒸馏水，加热温度均为100 ℃，超声处理120 min（ n =3）。按“2.3.1”项下方法核算败酱多糖提取率。见图3。败酱多糖的提取率随着料液比增加而增加，在1∶ 25时达到最大值（3.28±0.09）%，然后随着水料比的进一步增加，产量没有再明显增加。将下一步试验料液比定为1∶ 20～1∶ 30。

2.3.4 提取次数 取适量药渣，精密称定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加蒸馏水，和物料的比例为1∶ 20，加热温度均为95 ℃，超声提取120 min，提取次数分别为1、2、3、4、5次（ n =3），按“2.3.1”项下方法核算败酱多糖提取率。见图4。由图可知，增加提取次数，提取率明显提高，在3次时达到峰值（3.52±0.178）%，再增加提取次数至5次，败酱多糖产量并没有提高，故选择提取次数为3次。

2.4 正交试验 在上述试验的基础上，选择影响因素为提取温度（80 ℃、90 ℃、100 ℃）、提取时间（2 h、2.5 h、3 h）、料液比（1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30），评价指标为败酱多糖提取率，L9（34）为正交表进行正交试验，每组平行3个。见表1。

由表1可知，正交试验3个因素影响大小为：提取温度>料液比>提取时间，所得最佳提取工艺为A3B3C2。由方差分析表2可知，在3个影响因素中，提取温度的影响较显著（ P <0.05），其余2个因素无显著影响（ P >0.05）。

2.5 正交验证试验 按照最优工艺提取败酱多糖，3次的提取率为3.47%、3.39%、3.40%，平均值3.42%，表示该提取工艺稳定性较好。

2.6 多糖精制及其光谱测定 采用Sevage法对败酱多糖溶液除蛋白[7-9]得精制多糖。将其配成100 μg/mL的溶液，在190～400 nm波长内扫描，得其在260 nm、280 nm处均无杂质吸收峰，表明精制的败酱多糖不含蛋白质和核酸。

2.7 败酱多糖体外活性测定

2.7.1 PSP还原力测定 根据DENG等[11]文献中的方法对PSP的还原力进行了评价。反应混合物中含：2.5 mL磷酸盐缓冲液（pH值6.6），2.5 mL铁氰化钾（1%）和PSP（100～2 000 mg/L）。在50 ℃条件下培养30 min后，取出后加入将2.5 mL三氯乙酸（10%），摇匀、离心（1 200× g）10 min。收集上清液2.5 mL于新试管中，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL FeCl3（0.1%），溶液摇匀，室温培养15 min，测定700 nm吸光度值。以相同浓度的VC为阳性对照。见图5。由图可知，随败酱多糖浓度增加总还原力升高，但比相同浓度的Vc要低。总还原力可以反映潜在的抗氧化活性[12]，由此可见，PSP的还原力较小。

2.7.2 DPPH自由基清除能力測定 参考Shimada等[13]的方法做DPPH自由基清除测定实验是，过程略作调整。向试管中加入2 mL DPPH（每95%乙醇中含0.1 μg/mol）和2 mL PSP（100～2 000 mg/L）。在25 ℃下培养15 min，以Vc作为阳性对照，在517 nm下测定其吸光度值。用95%乙醇代替样品作空白对照，记A0，用以下公式对PSP的抗氧化活性进行了评价：

清除率/%= A0-（Ai-Ai0） A0 ×100%

其中Ai为PSP/VC的吸光度，A0为DPPH溶液的吸光度。

DPPH是1，1-二苯基-2-吡啶酰肼，是一种稳定的自由基，能接受氢自由基或电子，成为一种稳定的抗磁分子，被广泛应用于自由基的测定[14-15]。同时，DPPH自由基稳定性好，最大吸收波长为517 nm，具有较好的抗氧化能力。PSP对自由基的清除作用结果见图6所示，在100～500 mg/L浓度范围内，PSP和VC对DPPH自由基均有明显的清除活性，浓度为500 mg/L时，PBP的清除率可达到88.4%，但在浓度为500 mg/L（500～2 000 mg/L）时，清除活性无明显提高。PSP对DPPH自由基清除活性的EC50值为105 mg/L，VC的EC50值为42 mg/L，得出多糖清除DPPH自由基的能力是Vc的40%。

2.7.3 羟自由基清除能力测定 羟自由基清除活性实验采用Winterburn CC等[16]的方法进行测定。反应混合物中含：1 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.4）、1 mL浓度为40 g/mL的琥珀酸钠、1 mL 0.945 mm的EDTA-Fe（Ⅱ）、1 mL 3%（v/v）的H2O2和0.5 mL的PSP（100～2 000 mg/L）。37 ℃培养30 min后，以VC为阳性对照在560 nm处测定吸光度。以蒸馏水代替样品，记A0，用以下公式计算PSP清除羟自由基的能力：清除率（%）=（A0- Ai）/A0×100%，公式中A0指空白的吸光度，Ai为PSP/VC的吸光度。羟基自由基很容易穿过细胞膜，容易与大多数生物分子（包括细胞中的碳水化合物、蛋白质、脂质和DNA）发生反应，从而造成组织损伤或细胞死亡，羟自由基的清除对于保护生命系统至关重要[17-18]。PSP对羟自由基的清除率结果见图7所示，样品浓度范围为0.1～1 mg/mL。在此基础上，随着样品浓度的增加，其清除活性迅速增加。PSP的EC50值为1 705 mg/L，VC的EC50值为490 mg/L，得出多糖清除羟基自由基的能力是Vc的28.74%。

2.7.4 超氧阴离子清除能力测定 采用了Wang CY等[19]的方法测定了超氧阴离子自由基清除活性程度。用4.5 mL的50 mmol Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）与4.2 mL去离子水混合，在25 ℃的条件下培养20 min后，加入1 mL的PSP溶液和0.4 mL的焦性没食子酸。将所得混合物快速摇匀，在25 ℃的条件下培养5 min，立即在混合物中加入8 mmol盐酸终止反应，并在320 nm处测其吸光度值，用Vc作阳性对照。用以下公式计算清除能力：清除率（%）=（A0- Ai）/A0×100%，公式中A0指空白的吸光度，Ai为PSP/VC的吸光度。超氧阴离子作为单线态氧和羟基自由基的前驱体之一，间接引发脂质过氧化。此外，超氧阴离子的存在还会加重细胞的损伤，因为它会产生其他种类的自由基和氧化剂[20]，超氧自由基清除试验的结果见图8所示。Vc对其的清除率与其浓度成正比。PSP对其的清除率随浓度的增加而增加，PSP的EC50值为1 705 mg/L，VC的EC50值为357 mg/L，得出多糖对超氧阴离子的清除能力是Vc的20.4%。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，通过正交试验的方法，对提取时间、提取温度、水料比等3个自变量的影响进行了评价，研究了败酱中水溶性多糖的提取。败酱多糖的最佳提取条件为：提取温度100 ℃，水料比25∶ 1，提取时间3 h，提取次数3次。此工艺下，PSP的得率为（3.42±0.27）%，得到了高产、优质的生物活性多糖。

败酱多糖具有抗氧化能力，由实验结果可知，PSP对DPPH自由基具有较高的自由基清除活性，对羟自由基和超氧阴离子有清除活性。

本研究通过正交试验，为大规模生产PSP提供了最佳的提取工艺，PSP可被作为一种新型和潜在的天然抗氧化剂，用于功能性食品或医药产业。

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（2019-12-10收稿 责任编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81303292）——五味子乙素对非酒精性脂肪肝的作用和分子机制研究作者简介：尉捷（1980.07—），女，博士，副教授，研究方向：中藥的活性成分研究，E-mail：xiaoxuyujie@163.com通信作者：王育林（1958.04—），男，博士，教授，研究方向：中医医史文献，Tel：（010）64799902，E-mail：lionw@vip.sina.com