金钗石斛查尔酮合酶基因的生物信息学分析

徐 僡,高方平,郑远静,周娜娜,孙 威,2*

(1.贵州师范大学 生命科学学院/植物生理与发育调控重点实验室,贵州 贵阳 550025;2.西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室,贵州 贵阳 550025)

0 引言

金钗石斛(Dendrobiumnobile)简称金钗，其“色泽堪比金钗、茎似钗股、无歧、侧枝如钗、股短而中实”，是一种传统的名贵中药[1]。《本草纲目》中记载，金钗石斛具有滋阴润肺、益胃补肾、建脑明目、生津止渴、润肺止咳、预防感冒、抵抗疲劳等功效。同时，其花色绚丽、花姿秀美、花香沁人心脾，亦为世界著名观赏花卉之一[2]。有研究显示，金钗石斛富含生物碱类、多糖类、黄酮类等多种生物活性成分，主要分布在长江以南的亚热带地区(如：贵州、云南、广西、四川、湖南、湖北、福建等)[3-4]。目前，国内外关于金钗石斛生物碱及多糖类化合物的研究报道较多，但关于其黄酮类化合物的研究却鲜有报道。

黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，一方面它能够调节植物生长、抵抗紫外辐射、作为植物抗毒剂和活性氧清除剂；另一方面黄酮类化合物还具有多种药理活性，如，抗氧化、抗肿瘤、调节机体免疫力、清除自由基等[5-6]。Huang等[7]研究显示，黄酮类化合物的生物合成受苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、异黄酮合成酶(IFS)等一系列酶的调控，其中查尔酮合酶是其生物合成过程中第一个限速酶和关键酶，催化三分子的丙二酰辅酶A和一分子对羟基苯丙烯酰辅酶A缩合生成柚配基查尔酮，为黄酮类化合物的生物合成提供基本碳链骨架。随后，徐文燕等[8]发现，该柚配基查尔酮再通过异构化或取代反应生成黄酮、异黄酮、花色素苷等重要的中间产物。自1983年有研究者首次从荷兰芹中成功克隆得到查尔酮合酶基因以来，该基因已陆续从玉米、兰花、拟南芥、矮牵牛等多种植物中成功克隆并鉴定[9-10]。CHS基因属于一个较大的基因家族，是聚酮化合物合酶(PKS)超家族的一个分支，不同成员间CHS基因的表达模式各不相同，且不同拷贝间也存在明显的表达时间差异性和器官特异性。基于此，本研究利用生物信息学工具及方法对金钗石斛查尔酮合酶的理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构、三级结构、亲水性/疏水性以及系统进化等进行分析，以期为该酶的功能解析及金钗石斛的药用、观赏等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

金钗石斛查尔酮合酶的碱基序列来源于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)[11]。

1.2 方法

首先通过ORF Finder在线工具查找金钗石斛CHS基因完整的开放式阅读框[11]；采用ExPASy-ProtParam tool的ProtParam程序统计DnCHS基因所编码的氨基酸类型及含量，并预测其理论分子量和等电点[12]；应用Signal P-5.0 Server与PSORT对其信号肽及亚细胞定位进行预测[13-14]；蛋白质二级结构及三级结构预测分别选用PHD和SWISS-MODEL[15-16]；随后，通过ExPasy-ProtScale 在线软件预测DnCHS氨基酸的亲/疏水性[17]；最后利用MEGA 7软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 DnCHS的理化性质分析

由ORF Finder在线工具查找DnCHS基因的开放阅读框(ORF)可知：DnCHS基因完整的开放式阅读框长度为1 188 bp，共编码395个氨基酸，由20种氨基酸组成，其中含量最高的是亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)，分别占10.9% 和10.1%，而吡咯氨基酸(Py1)和硒半胱氨酸(Sec)的含量为0。随后，采用ExPASy在线软件对DnCHS的氨基酸序列进行理化性质分析，结果显示(见图1)，DnCHS基因翻译后形成的蛋白质分子量为43.10 kD，理论等电点为6.22，负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)总数为45个，正电荷氨基酸残基总数(Arg + Lys)为42个，蛋白质分子式为C1921H3078N524O565S17，半衰期为30 h，不稳定指数为44.76，属于不稳定蛋白。其平均疏水性为-0.022，脂肪系数为95.62，表明DnCHS蛋白为一种亲水性蛋白。

图1 金钗石斛CHS基因的cDNA序列Fig.1 Nucleotide acid sequence of DnCHS gene

2.2 DnCHS蛋白信号肽分析

信号肽一般由15～30个氨基酸组成，位于新生肽链的N端，能够引导其进行跨膜转移，从而实现定位运输。DnCHS蛋白信号肽分析结果显示，在其第49个氨基酸残基处出现最大C值(原始剪切位点分值)，第11个氨基酸残基处出现最大Y值(综合剪切位点分值)，分别为0.113和0.114，最大S值(信号肽分值)为0.156，位于第34个氨基酸处，平均信号肽最大得分值为0.133(见表1)，未超过阈值0.5，因此，推测该蛋白不具有信号肽序列(见图2)。

表1 DnCHS蛋白信号肽预测Tab.1 Signal P-NN prediction for DnCHS protein

图2 DnCHS蛋白信号肽预测Fig.2 Signal P-NN prediction for DnCHS protein

2.3 DnCHS蛋白的亚细胞定位分析

亚细胞定位是指某种蛋白质或某种基因的产物在细胞内的具体存在部位，包括细胞核、细胞质和细胞膜等，其存在部位与所行使的功能密切相关。通过PSORT在线工具对DnCHS进行亚细胞定位分析，结果显示(见表2)：DnCHS蛋白定位在细胞质中的概率为45%，定位在叶绿体基质和叶绿体类囊体膜中的概率分别为20%和28%，而定位在微体中的概率为30%。因此，DnCHS蛋白定位在细胞质中的可能性最大。

表2 DnCHS的亚细胞定位Tab.2 Subcellular location of DnCHS protein

2.4 DnCHS蛋白二级与三级结构预测分析

通过Predictprotein在线软件对DnCHS蛋白的二级结构进行分析，结果显示(见表3)：DnCHS蛋白的二级结构由33.92%的α螺旋、8.35%的延伸链和57.72%的无规则卷曲组成，不含有β转角。同时，利用SWISS-MODEL在线软件对DnCHS蛋白的三级结构进行分析，其三级结构组成与二级结构相一致(见图3)。

表3 CHS蛋白的二级结构Tab.3 The Secondary Structure of CHS protein

图3 DnCHS蛋白的空间构象Fig.3 The conformation simulation of DnCHS protein

2.5 DnCHS蛋白的亲/疏水性分析

蛋白质氨基酸的亲疏水性能反映蛋白质的折叠情况。利用ExPasy-ProtScale在线软件分析DnCHS蛋白的亲/疏水曲线，结果显示(见图4)：该蛋白的最高值为2.422，在第344个氨基酸处，具有最强疏水性；在第121个氨基酸处，亲水性最强，得分值为-2.556。从金钗石斛DnCHS蛋白的亲/疏水曲线分布来看，整条肽链的氨基酸预测值大部分为负值，不存在明显的疏水区域，因此推测，DnCHS蛋白是一种亲水性蛋白。

图4 金钗石斛CHS蛋白亲水性/疏水性预测Fig.4 Predicted hydrophobicity of DnCHS protein

2.6 DnCHS的系统进化分析

在NCBI数据库中搜索并下载已报道的CHS家族氨基酸序列共15条，随后，利用MEGA 7软件将DnCHS基因相应的氨基酸序列与其它15种植物CHS基因的氨基酸序列进行多重序列比对，并构建进化树。由图5可知，DnCHS与红掌亲缘关系最近，与其他植物同源性较远。

注:RsCHS CAC88858.1(Rhododendron simsii);CjCHS BAI66465.1(Camellia japonica);AmCHS ACE60221(Abelmoschus mani);NnCHS ADD74168.1(Nelumbo nucifera);SmCHS ABC71308(Saussurea medusa);HlCHS CAK19317.1(Humulus lupulus);CsCHS AAL92879( Cannabis sativa);NtCHS ACS12837.1(Nicotiana alata);PhCHS AAB36038.1(Petunia x hybrida);FhCHS1 AEO45114(Freesia hybrida);IgCHS BAE53636(Iris germanica);GmCHS CAA46590(Glycine max);ZmCHS NP_001149022(Zea mays);SbCHS AAD41873.1(Sorghum bicolor);AaCHS ABE01413.1(Anthurium andraeanum);DnCHS was maked by red dot.

3 讨论

本研究通过生物信息学工具和方法对金钗石斛查尔酮合酶基因进行分析，结果表明，DnCHS基因完整的开放式阅读框长度为1 188 bp，共编码395个氨基酸，翻译形成蛋白的分子量为43.10 KD，理论等电点为6.22，属于不稳定蛋白，且该蛋白为一种亲水性蛋白，与红掌的亲缘关系最近。从DnCHS的碱基组成来看，其G+C含量大于50%，汪结明等[18]研究表明，G+C的含量越高，基因稳定性越高。因此，推测DnCHS基因处于相对稳定的状态，有助于该基因在进化过程中稳定遗传。

本研究显示，DnCHS蛋白可能定位于细胞质中，与兔眼蓝莓[19]、日本蛇根草[20]、铁皮石斛[21]等植物中CHS蛋白的亚细胞定位相同，这可能是CHS蛋白定位与该蛋白主要参与植物次生代谢物的合成和调控有关。信号肽分析显示，DnCHS蛋白不存在信号序列，也不存在明显的疏水结构，从侧面说明该蛋白不参与跨膜转运，该结果与青天葵[22]、桑树[23]和草地早熟禾[24]的CHS蛋白研究结果相似。可见，分析金钗石斛CHS基因及其系统进化，有利于解析该基因在植物次生代谢途径中的功能。

CHS是黄酮类化合物合成途径中一个非常关键的限制因子，参与该途径中重要中间产物查尔酮的形成。刘秀明等[25]研究显示，通过提高CHS的表达量可提高植物或植物细胞内查尔酮的含量，进而提高黄酮类物质的含量。此外，CHS对植物花色、育性、防御等生理生化过程也具有重要意义[5]。如：在矮牵牛和烟草中表达“反义”查尔酮合成酶基因导致其花色素含量减少，花色变浅或变为无色[26-27]；当矮牵牛的查尔酮合酶基因表达受到抑制时，会产生缺乏类黄酮色素的异常花药，影响其育性[28]；当植物体受到外源病原微生物侵害时，其体内CHS活性显著增强，表明由该酶参与的植物次生代谢物合成过程很可能是植物抵抗外源病原物侵害的重要反应之一[29-30]。可见，研究金钗石斛查尔酮合酶基因，不仅可提高金钗石斛的抗逆能力，改善该药材的产量及品质，还可为丰富金钗石斛的花色类型提供基因资源。