番茄果实成熟过程中色素合成相关基因的表达分析

陈远志，孙杨莹，叶必顺，赖童飞

(杭州师范大学生命与环境科学学院，植物RNA信号传导中心，浙江 杭州 311121)

番茄(Solanumlycopersicum)属于双子叶植物纲，茄属，番茄亚属，其果实味道鲜美，色泽鲜艳，富含维生素A和C、苹果酸、柠檬酸、芦丁以及番茄红素等营养物质，具有较高的食用和药用价值.番茄果实成熟的过程伴随着生理、生化指标的剧烈改变[1]，根据番茄果实颜色变化主要分为绿熟期、破色期、粉红期和红熟期.绿熟期果实体积不再增大，果肉坚硬，果皮呈现绿色；破色期果实坚硬，果顶开始变红，种子基本成熟；粉红期果实果皮大部分转红，果肉尚未软化，种子完全成熟；红熟期果实完全变红，果肉开始软化，含糖量较高[2].番茄果实颜色主要与果皮与果肉中叶绿素、类胡萝卜素及类黄酮等色素物质的积累及相对比例有关，不但具有较高的观赏价值，还是评估果实营养及医用价值的重要标志.例如，成熟期番茄果实中的主要色素物质番茄红素具有抗氧化、增强免疫力、降低心血管疾病等作用，而富含的β-胡萝卜素进入人体后可成为维生素A的重要来源[3-4].

番茄果实中类胡萝卜素在叶绿体和色素母细胞中合成，主要通过MEP(Methyl-D-erythritol 4-phosphate)途径合成IPP(Isopentenyl pyrophosphate)，在经过一系列酶促反应依次生成八氢番茄红素、番茄红素以及β-胡萝卜素等[5].番茄果实中类黄酮物质的合成均起始于查尔酮合成酶的催化，通过不同代谢途径形成黄烷酮、黄酮醇以及花青素等色素物质[6].Shinozaki等通过高分辨率转录组分析表明，查尔酮合成酶基因SlCHS-2在番茄表皮细胞中大量表达并引起黄酮类色素的积累，与其共表达的还包括类黄酮合成途径中6个重要催化酶的编码基因和1个MYB家族转录因子基因[1].

番茄果实色素合成受到种植条件、环境因素、激素以及发育阶段等多方面影响.例如，红光(波长600 nm)及远红光(波长730 nm)能够通过光敏色素介导番茄果实中番茄红素的合成[7]；乙烯能够通过受体ETRs调控番茄红素合成酶的表达[8]；外源赤霉素(ABA)处理能够提高类胡萝卜素的合成并引起叶绿素的降解[9-10]；生长素(IAA)能够延缓番茄果实从绿色到红色的转变[11]；浓度为50 μM的褪黑素处理能够引起8个花青素合成相关蛋白表达改变，并提高成熟番茄果实中花青素的含量[12].在果实内部，大量的microRNAs在番茄类胡萝卜素合成过程中发挥着调节作用[13]，同时许多转录因子(如RIN、TAGL1、CNR等)不但能够通过激素介导的信号传导途径间接调控番茄果实色素的合成[14-16]，还可以直接参与色素合成相关基因的调控.例如LeMADS-RIN、LeTDR4、STAY-GREEN以及SlBBX20均可以与SlPSY1的启动子区域结合并限制其活性[17-20]；8个WRKY转录因子家族的成员能够与4个番茄果实颜色改变相关基因(SlPPH、SlPAO、SlPSY1和SlPDS)的启动子区域互作[21]；MYB转录因子家族的SlAFT与highpigment-1基因有密切的相关性[22].此外，近年来还有很多果实色素物质合成调控机制研究的报道，Gupta等(2014)发现光敏色素PHYA、PHYB1以及PHYB2能够抑制番茄红素以及β-胡萝卜素的积累[23]；过表达AtORANGE、AtPDS或者SlAN2能够促进番茄果实类胡萝卜素的积累[24-26].由此可见，加深对番茄色素合成途径及相关调控基因的了解是研究番茄果实品质性状的重要内容和方向.

本研究拟通过相关生理、生化及分子指标检测，对番茄果实成熟过程中色泽及主要色素物质含量变化进行分析，评估调控色素合成的转录因子基因、类胡萝卜素及类黄酮合成途径中关键基因的表达规律，加深对番茄果实色素合成及其调控机制的理解，为利用分子遗传手段定向调控番茄果实色素含量，提高番茄果实品质性状及商品属性提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

番茄(Solanumlycopersicumcv. Ailsa Craig)培养在无虫害、病害的温室中，保持温度25 ℃及湿度80%，每日光照16 h，定期补充营养液，记录开花时间及果实破色日期.

主要试剂包括植物总RNA提取试剂盒(Cat.74904，Qiagen，Germany)，Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒(KR106，Tiangen，China)，Ultra SYBR mixture(CW0956，CW Bio，China)，苏丹Ⅰ、槲皮素、六水氯化铝及其他常规试剂购自生工生物工程(上海)有限公司.

主要仪器包括WSC-S测色色差计(上海精科)，核酸蛋白分析仪(SmartSprec Plus，Bio-Rad，USA)，CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA).

1.2 番茄色素相关指标检测

分别收集开花后30 d、破色期、破色后5 d以及破色后10 d的果实，使用数码相机(EOS600D，Canon，Japan)记录果实表型.利用WSC-S测色色差计检测果实表皮色差，光源为标准光源D65，色温为6500 K，检测严格按照仪器使用说明进行.每个时期选择15个果实，在每个果实赤道部位选择3个点进行测量，每个检测点间隔120°，检测结果利用国际照明委员会CIE-L*a*b*表色系统表示.

参考Wang等[27]方法检测叶绿素含量，准确称取10 g果肉，在液氮中研磨至粉状后转移至80%的丙酮溶液中，充分搅拌后定容至50 mL，将混合液离心并保留上清，在645 nm(叶绿素a)和663 nm(叶绿素b)波长处检测上清液的吸光度，总叶绿素含量=8.33×(8.02×OD663+20.20×OD645)μg/g(以鲜质量计).

配制0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的苏丹Ⅰ代替番茄红素标准品，在485 nm波长下测定溶液吸光度，一元线性回归方程为y=0.2764x+0.0013，相关系数R2=0.9954.准确称取10 g果肉，在液氮中研磨至粉状后加入适量甲醇，充分搅拌后离心弃上清，沉淀利用甲醇重复漂洗至上清无色，利用50 mL三氯甲烷充分提取沉淀中的番茄红素，检测提取液在485 nm波长下的吸光度并计算番茄红素浓度.

利用氯化铝比色法检测果实样品中总类黄酮含量[28]，准确称取1 g果肉，在液氮中研磨至粉状转移至1 mL去离子水中.取0.5 mL加入1.5 mL 95%乙醇、0.1 mL 10%的六水三氯化铝溶液、0.1 mL浓度为1 mol/L的醋酸钾溶液以及2.8 mL去离子水，室温反应40 min，检测溶液在415 nm波长处的吸光度.利用0～50 mg/L浓度范围的槲皮素(Queretin)标准品制作标准曲线，一元线性回归方程为y=0.0043x+0.0095，相关系数R2=0.979.总类黄酮含量以每千克鲜质量的槲皮素当量(mg)表示.

参考Zhang等[29]方法检测果实样品中花青素含量，准确称取10 g果肉，在液氮中研磨至粉状后转移至含有0.1 mol/L盐酸的甲醇溶液中，充分搅拌后定容至50 mL，将混合液密封并在避光条件下静置24 h，随后将混合液离心并保留上清，检测上清液在525 nm波长处的吸光度，利用吸光度值表示花青素在果肉中的相对含量.

1.3 色素合成相关基因表达分析

分别收集开花后30 d、破色期、破色后5 d以及破色后10 d的果实，在液氮中充分研磨后，利用植物总RNA提取试剂盒提取果实样品的总RNA，Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应.利用实时定量PCR方法检测色素合成相关基因的相对表达量，调控色素合成转录因子基因的定量引物序列参考Wang等(2018)[30]，类胡萝卜素合成相关基因的定量引物序列参考Su等(2015)[11]，类黄酮合成相关基因的定量引物序列参考Pandey等(2015)[31].反应体系为20 μL：10 μL 2×Ultra SYBR mixture，1 μL cDNA，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，8 μL H2O.实时荧光定量PCR仪运行条件为：95 ℃预热10 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共运行40个循环.CFX96 Real-Time PCR Detection System记录SYBR Green的荧光变化及threshold cycle(Ct)值.内参基因选择18srRNA，目标基因的相对表达量用2-△Ct表示.

1.4 统计分析

每个实验至少进行3次生物学重复.数据分析使用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)软件，采用单因素方差分析，多重比较采用One-way ANOVA以及Duncan’s multiple range检验，P<0.05时表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 番茄果实成熟过程中相关色素含量变化

番茄在开花后30 d左右进入绿熟期，果皮由青绿色逐渐泛白；开花后35～40 d左右进入破色期，此时15%～20%的果皮变为浅黄或浅红色；破色后5 d，除果肩外至少3/4的果皮转变成黄色或红色；破色后10 d，果皮完全转红(图1).表1利用CIE-L*a*b*表色系统对果皮颜色的变化进行了定量描述，随着果实从绿熟期向红熟期转化，果皮颜色从绿色色度向红色色度转变，黄色色度呈现先上升后下降的趋势.

A：开花后30 d的果实；B：破色期果实；C：破色后5 d的果实；D：破色后10 d的果实.

表1 番茄果实成熟过程中的颜色变化Tab.1 The color changes during tomato fruit ripening

番茄果实成熟过程中番茄红素及类黄酮含量逐渐升高，破色5 d后含量显著增加；同时，叶绿素的含量逐渐降低，破色5 d后叶绿素含量保持在较低的水平；花青素在果实中含量较低，在果实成熟过程中变化不显著.相关色素的含量变化与果实表型的变化基本一致(图2).

30 DPA：开花后30 d的果实；Breaker：破色期果实；5 DPB：代表破色后5 d的果实；10 DPB：破色后10 d的果实，误差棒代表标准偏差.

2.2 调控色素合成相关转录因子基因的表达变化

转录因子能够通过直接或者间接的方式调控番茄果实色素物质的合成.在番茄果实成熟过程中，SlAP2a、LeMADS-RIN、LeNAC-NOR、LeSPL-CNR和LeTDR4呈现先上升后下降的表达趋势，且峰值多集中于破色后5 d；SlMADS1、SlTAGL1以及LeHB1在绿熟至破色期之间呈现下降趋势，随后表达量上升，破色后5 d后逐渐下降；而SlMYB12的表达则随着番茄果实的成熟逐渐下降(图3).

图3 番茄果实成熟过程中调控色素合成相关转录因子基因的表达变化Fig.3 Expression changes of transcription factor genes involved in egulating pigment biosynthesis during tomato fruit ripening

2.3 类胡萝卜素合成途径相关基因的表达变化

番茄成熟过程中类胡萝卜素含量变化非常明显，通过相关基因表达检测发现，PSY1、PDS、ZDS、ZISO以及NCED在绿熟至破色后5 d期间表达量呈现上升趋势，随后开始逐渐下降；PSY2、β-LCY、ZEP、β-CRTR以及ABA4的表达从绿熟期开始下降，果实破色后逐渐上升，破色后5 d达到顶点，随后逐渐下降；而ε-LCY及NXD在绿熟期表达量最高，随后逐渐下降，果实破色后则保持在一个较低的表达水平，且表达差异不显著(图4).

PSY：番茄红素合成酶；PDS：番茄红素去饱和酶；ZDS：ζ-胡萝卜素去饱和酶；ZISO：ζ-胡萝卜素异构酶；β-LCY：β-番茄红素环化酶：ε-LCY：ε-番茄红素环化酶；ZEP：玉米黄质环氧酶；β-CRTR：β-番茄红素羟化酶；ABA：脱落酸；NXD：新黄质合成酶；NCED：9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶.

2.4 类黄酮合成途径相关基因的表达变化

番茄中含有大量类黄酮物质，它们是一类多酚化合物，作为天然色素，对番茄果实的颜色具有重要意义.通过对类黄酮合成途径相关基因表达检测发现，PAL、4CL、C3H、HQT、CHS、F3’5’H、F3’H、F3H、FLS以及DRF在果实成熟过程中呈现先上升后下降的表达趋势，其中大部分基因在破色期表达量最高，而4CL、HQT以及DRF在破色后5 d表达量最高；C4H、HCT、CHI、GT以及RT在番茄成熟过程中呈现逐渐下降的表达趋势，其中C4H在成熟前期变化不显著，破色5 d后才逐渐下降；ANS在绿熟期表达逐渐下降，破色期后逐渐上升，在破色5 d后达到顶点，随后逐渐下降(图5).

PAL：苯丙氨酸解氨酶；4CL：4-苯并呋喃-辅酶-连接酶；C4H：4-肉桂酸羟化酶；HCT：羟基苯丙烯转移酶；C3H：p-香豆酸-3-羟化酶；HQT：羟基苯丙烯-辅酶-奎尼酸-羟基苯丙烯转移酶；CHS：查耳酮合成酶；CHI：查尔酮异构酶；F3’5’H：类黄酮-3’5’-羟化酶；F3’H：类黄酮-3’-羟化酶；F3H：黄烷酮-3-羟化酶；FLS：黄酮醇合成酶；DFR：二氢黄酮醇-4-还原酶；GT：葡糖基转移酶；RT：鼠李糖基转移酶；ANS：花青素合成酶.

3 讨论

作为呼吸跃变型模式植物，番茄果实色素含量的变化规律及其相关代谢途径的研究备受关注.已有研究表明，LeMADS-RIN能够直接正向调控PSY1、PSY2、ZISO、ZDS的表达，间接负向调控ε-LCY及β-CRTR的表达，本研究中LeMADS-RIN正向调节基因和负向调节基因具有不同表达趋势，这与前人的研究结果是一致的[17].同属MADS家族的SlMADS1是果实成熟的负调控因子，对PSY1的表达具有抑制作用[32]，因此SlMADS1在果实成熟过程中呈现下降趋势，并维持较低的表达丰度.此外，SlTAGL1、LeSPL-CNR、LeNAC-NOR以及LeHB1均位于LeMADS-RIN调控网络下游，对果实颜色的形成具有间接的调控作用[15,18,33]，通过表达分析比较发现，这些转录因子基因的表达趋势与LeMADS-RIN相似.SlAP2A属于AP2/ERF家族，能够以负反馈机制调控果实色质体分化、类黄酮及类胡萝卜素的合成[34]，本研究检测结果表明SlAP2A在红熟期维持较高的水平.番茄中R2R3MYB家族的转录因子SlMYB12主要控制柚皮苷查尔酮的合成，降低SlMYB12的表达，能够使番茄果实产生粉色表型[35]，本实验中SlMYB12表现出逐渐下降的趋势，推测相关代谢产物的合成相对于基因表达具有一定滞后性.

类胡萝卜素是萜类化合物衍生物，番茄成熟过程中能够积累大量类胡萝卜素，主要发生在叶绿体中的类囊体膜破坏、质体变成有色体时.番茄中至少含有12种类胡萝卜素，其合成途径已经较为清晰，通过47个酶基因表达的24种不同的酶，使异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)通过共价缩合及分别环化生成β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，再经过连续羟基化及氢化反应生成叶黄素和玉米黄素，最终通过环氧化作用生成新黄质[36-37].PSY是类胡萝卜素合成途径的关键限速酶，已知的3个PSY基因中，PSY1对于类胡萝卜素的合成起主要作用[38].ZDS能够催化ζ-胡萝卜素生成番茄红素，是类胡萝卜素含量增加的关键酶[39]；ZISO是ζ-胡萝卜素异构酶，主要作用是将番茄红素顺式构象转变为全反式构象，是整个途径中表达量最高的基因之一[40].本研究中，这3个酶的基因均呈现先上升后下降的表达趋势，对番茄从绿转红起决定作用.β-LCY和ε-LCY是番茄红素环化酶，是催化番茄红素生成β-胡萝卜素和δ-胡萝卜素的重要酶，与番茄红素的含量呈负相关，因此在成熟过程中表达量较低.NCED是9-顺式-环氧-类胡萝卜素双加氧酶，主要作用是修饰新黄素和紫黄质形成重要的植物激素ABA，定量分析发现其表达情况与该途径的主要限速酶基因表达趋势相一致.

番茄果实成色物质中还包含大量类黄酮物质，它们具有三环苯基苯并吡喃结构，根据杂环上取代基不同而呈现不同颜色.同时，类黄酮还是一种天然抗氧化剂，在医药和食品领域被广泛使用[41].番茄类黄酮次生代谢途径的主要结构基因已经被大量发掘，首先苯丙氨酸在PAL、4CL以及C4H的催化下形成类黄酮物质的前体4-Coumaroyl CoA，随后一方面通过HCT、C3H、HCT、HQT的催化作用与Quinic acid和Caffeoyl CoA形成Tricaffeoyl quinic acid，另一方面在CHS的作用下与3个Malonyl CoA合成Naringenin-chalcone，进而通过CHI形成Naringenin，通过F3’H和F3H催化的酶促反应形成Aglycone骨架.在此基础上，通过FLS、GT和RT的催化作用形成Rutin，或者通过FLS、DRF、ANS的催化作用形成花青素[6,31].其中CHS是主要的限速酶[42]，本实验中，CHS在果实破色期表达量最高，随后逐渐下降，大部分下游相关基因与CHS具有相同的表达趋势.

番茄果实中的色素物质不仅为果实提供了美丽的颜色，还是重要的营养成分，随着现代生物技术的发展以及相关基础研究的深入，定向改变番茄果实色泽以及色素相关物质含量是现代番茄育种的方向之一.本研究结合生理、生化及相关分子指标检测，对番茄果实成熟过程中主要成色物质类胡萝卜素和类黄酮物质的含量变化进行了评估，较为全面地描述了调控番茄果实色素合成相关转录因子基因的表达动态，揭示了番茄果实色素合成途径中关键基因的时序性表达规律，研究结果为通过利用分子遗传途径提高番茄果实中功能性成分含量，培育优质品种提供了理论基础.