苯噻草胺除草剂暴露对中华鳖胚胎发育及孵出幼体表型的影响

黄心怡，周 瑞，胡佳颖，金 典，张辰欢，陆洪良

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

苯噻草胺(英文名mefenacet，分子式C16H14N2O2S)是20世纪80年代研发的一种酰胺类除草剂，主要通过抑制禾本科杂草细胞生成和分裂而达到除草的效果[1].因其低毒、高效除草作用，苯噻草胺在我国水稻田间得到了广泛的应用.在生产实践中，田间苯噻草胺施用后大部分在数天内得到降解(稻田水体半衰期1.6～2.1 d，土壤半衰期3.7～12.3 d[2]).然而，部分残留物及其降解产物仍可能长时间存留于水体或稻田土壤中，从而对生活于水体及土壤中的生物造成毒害作用[3-4].目前，仅有少数研究报道了苯噻草胺对包括浮游植物、两栖类幼体在内的水生生物毒理效应[4-6].例如，苯噻草胺的施用对稻田热带爪蟾(Siluranatropicalis)蝌蚪显示出微弱的毒害作用[5].

龟鳖类动物大部分时间生活于水体中，水中的农药残留物可能会在其体内不断累积而造成长期伤害.中华鳖(Pelodiscussinensis)是我国重要的水产经济动物，在南方各省区被广泛养殖.这些地区，中华鳖常养殖于紧邻稻田的人工池塘，稻田中施用的农药残留物很可能随水流进入养殖塘.此外，中华鳖卵常被产于水塘边堤岸的土壤中，发育中的胚胎潜在地会受到土壤中残余农药的毒害作用.检测稻田常用农药对中华鳖个体以及胚胎发育的作用，既可增加基础性的毒理学数据，也有助于商品中华鳖的食品安全风险评估.本文用不同浓度的苯噻草胺处理孵化过程中的中华鳖受精卵以检测该除草剂对其胚胎发育、孵出幼体形态、运动表现及肝脏生理的影响.

1 材料与方法

1.1 中华鳖受精卵收集

从余杭龟鳖养殖场购买新生的中华鳖受精卵150枚，带回实验室，测量每一卵的大小(直径和质量)并编号，随机分为5个不同苯噻草胺质量浓度处理组(蒸馏水组、助溶剂组(二甲基亚砜)、0.6、6.0、60.0 mg/L)，每组30枚.所有受精卵分配到含有-220 kPa湿度基质(m蛭石∶m水=1∶1)的孵化盒中，利用点光源确定胚胎位置，受精卵放入基质时将胚胎位置向上，并在每个胚胎上放置大小相等的纱布小圆片(打孔器打出)，孵化盒放置在预先设定为30 ℃的恒温孵化箱中孵化.每隔1 d检查是否有发霉的鳖卵，补充因蒸发失去的水分，并调节孵化盒在孵化箱内的相对位置，以排除孵化箱内部温差所造成的潜在影响.

1.2 中华鳖受精卵孵化处理

根据处理组浓度，每隔1 d用移液枪吸取100 μL的相应苯噻草胺溶液滴加在胚胎位置的中华鳖受精卵表面纱布上.在孵化过程中每隔3 d检查鳖卵的发霉情况，及时补充基质水分和移除霉变的卵.

1.3 幼体大小与运动表现

幼体孵出后，记录孵出时间以计算孵化期，检查其形态畸形情况，用电子天平测量幼体质量，待腹部卵黄完全吸收后，在29 ℃体温条件下测定幼体运动(游泳)表现.测定游泳表现时，将动物放在120 cm×10 cm×20 cm的玻璃泳道，用毛刷驱赶动物向前游动，同时用SONY DCR-SR220E数码摄像机拍摄动物在泳道中的游泳过程，随后分析行为录像.截取其中动物持续向前游动的3个不同视频片段，计算每一片段中动物游过25 cm距离的速度(cm/s)，取平均值用于后续统计分析.

1.4 幼体生长发育情况

孵化出的中华鳖幼体单独饲养于直径为20 cm的盒内，盒内含水高度约3 cm，定期喂食，每隔一个月用电子天平测量其质量，并与原来质量进行比较分析.

1.5 幼体肝脏生理指标

购买鱼甘油三酯(triglyceride, TG)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)ELISA检测试剂盒.随机选取刚孵出幼鳖每组10只，放置在碎冰上麻醉后解剖，取肝脏，并称重.将肝脏按照质量(g)∶体积(mL)=1∶9比例加入0.85%生理盐水，冰水浴上机械研磨成匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书来测定肝脏TG含量和SOD活力.将得到的中华鳖幼体肝脏湿质量除以其自身体质量来表示其肝脏指数.

1.6 数据处理

用SPSS 18.0软件包进行统计分析.对数据进行参数统计分析前，分别检验其正态性(Kolmogorov-Smirnov检验)和方差同质性(Bartlett检验).用单因子方差分析检测苯噻草胺处理对中华鳖受精卵大小、孵化期、孵出幼体游泳速度、肝脏生理指标的影响；以卵质量为协变量的单因子协方差分析检测苯噻草胺处理对孵出幼体大小(体质量)的影响；用重复测量方差分析检测孵出幼体早期生长情况；用卡方(χ2)检验检测不同浓度苯噻草胺处理组卵孵化成功率的差异.描述性统计值用平均值±标准误表示，显著性水平设置为α =0.05.

2 结果

2.1 不同浓度苯噻草胺对中华鳖胚胎发育的影响

入孵的中华鳖卵皆是受精卵，孵化过程中可见其受精白斑在不断扩大，直至整颗卵呈白色.不同处理组的初始卵质量无显著组间差异(F4, 148=1.17,P=0.326).苯噻草胺处理对孵化成功率(χ2=0.40,df=4,P=0.983)无显著影响，但苯噻草胺处理下的卵孵化时间有所缩短(F4,128=6.20,P<0.01)(表1).

表1 不同浓度苯噻草胺处理下中华鳖入孵卵大小、孵化率及孵化时间Tab.1 Egg size, hatching success and incubation period of Pelodiscus sinensis under different concentration treatments of mefenacet

2.2 不同浓度苯噻草胺对中华鳖孵出幼体大小和游泳速度的影响

苯噻草胺处理对孵出幼体大小(以卵质量为协变量的协方差分析：F4,126=1.06,P=0.377)和肝脏大小(以幼体质量为协变量的协方差分析：F4,39=1.80,P=0.149)无显著影响.苯噻草胺处理对孵出幼体游泳速度无显著影响(F4,80=1.76,P=0.146)(图1).

图1 不同苯噻草胺处理组孵出中华鳖幼体游泳速度Fig.1 Swimming performance of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.3 不同浓度苯噻草胺对中华鳖幼体生长发育情况的影响

孵出幼体在前3个月内体质量增加明显(F3,240=2333.05,P<0.001)，但是苯噻草胺处理对幼体早期生长的影响不显著(F4,80=0.89,P=0.477)(图2).

图2 不同苯噻草胺处理组中华鳖幼体的生长状况Fig.2 Growth status of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.4 不同浓度苯噻草胺对中华鳖幼体肝脏甘油三酯含量和超氧化物歧化酶活性的影响

苯噻草胺处理对孵出幼体肝脏指数无显著影响(F4,40=1.54,P=0.208)(图3).苯噻草胺处理对孵出幼体肝脏TG含量(F4,45=0.34,P=0.849)和SOD活性(F4,45=1.73,P=0.160)无显著影响(图4).

图3 不同苯噻草胺处理组中华鳖幼体的肝脏指数Fig.3 Liver index of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

3 讨论

爬行动物胚胎发育期是生命周期中最为脆弱的时期.胚胎期直接暴露于一定浓度的农药下可能造成胚胎死亡或者孵出幼体畸形影响后续生存表现.本研究测定的中华鳖所有变量(包括胚胎存活、孵出幼体表型及肝脏生理指标)在不同苯噻草胺浓度处理组间均无显著差异，表明在一定浓度条件下苯噻草胺暴露对中华鳖胚胎发育及幼体的影响是有限的.胚胎期除草剂暴露对其他龟鳖类动物无明显的毒害效应也见于其他研究，例如一定浓度的异丙甲草胺、草甘膦暴露对北美拟鳄龟(Chelydraserpentina)、红耳滑龟(Trachemysscriptaelegans)和中华鳖胚胎及孵出幼体表现的影响并不大[7-9].当然在高浓度除草剂处理下也检测到卵孵化成功率会有所降低[7].相反，杀虫剂(如毒杀芬、溴氰菊酯)暴露常会直接引起龟鳖类动物胚胎死亡[10-11].因此，与其他有机磷除草剂或杀虫剂农药相比，苯噻草胺对水生生物的毒害作用应是较低的.

已有研究也显示，不同浓度的苯噻草胺处理对热带爪蟾(S.tropicalis)蝌蚪的毒害效应不明显[4].在质量浓度为0.03和0.3 mg/L的苯噻草胺处理下，并没有观察到虚弱或者死亡的爪蟾蝌蚪，所检测的蝌蚪形态(脊柱侧位畸形)及行为变量(不协调游泳、过度通气、不典型静止等)与助溶剂对照处理个体亦无显著的差异[4].而在一项研究中显示，苯噻草胺处理对热带爪蟾24 h的中致死质量浓度为2.7～3.0 mg/L[5].此外，在不同藻类测试中，苯噻草胺的72 h半效应质量浓度为0.25～0.67 mg/L[6].虽然苯噻草胺对水生动物的毒性较低，但是其所造成的潜在毒害仍然存在.在一定浓度范围内，苯噻草胺处理是否影响水生动物遗传物质损伤、某些基因表达等毒理效应仍有待于后续研究.

本研究中华鳖孵出幼体肝脏生理指标(肝脏指数、TG含量和SOD活性)不随着苯噻草胺浓度的增加而改变，这与其他有机磷除草剂暴露的研究结果存在差异.例如，一些有机磷除草剂暴露可能导致受试动物肝脏脂肪积累而显示出致肥胖效应[12]，SOD活性上升[13-14].苯噻草胺污染引起的SOD活性变化仅见于一些细菌研究，显示出随苯噻草胺浓度增加，SOD活性先上升后下降的趋势[15-16].对于苯噻草胺暴露是否会引起水生动物肝脏生理及抗氧化防御反应变化的问题，仍需要在更多物种中进行相关测试才可能得以解答.