水稻盐敏感突变体ssm1的生理指标分析

张 晨，叶晨曦，熊二辉，武丽敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311112)

土壤盐碱化是影响农业生产的主要问题之一，全世界约有1/5的农田受高盐碱化的影响[1].水稻对盐胁迫较为敏感，特别是在幼苗期和生殖期，土壤盐碱化通过渗透胁迫、离子平衡和离子毒害等方式严重阻碍水稻的生长和发育[2].盐胁迫是一个复杂的过程，在植物体内诱导一系列生理生化反应，如种子萌发受阻[3]、生长受到抑制、光合能力下降[4]、膜透性增加和生物量下降[5].活性氧是有氧呼吸的代谢产物，主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧自由基(O2·-)等[6]，盐胁迫下植物体内活性氧平衡被打破，这些活性氧自由基对水稻植株的蛋白质、质膜、叶绿素及其他细胞组分造成损伤，而此时植物细胞会通过抗氧化防御机制严格控制细胞内活性氧的浓度[7].一旦体内负责清除活性氧的抗氧化系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶等酶活力下降，则会引起活性氧的大量积累，导致膜脂过氧化、生物膜系统受损，进而对植物的光合作用、呼吸作用等造成影响，使其能耗增加，衰老加速，最终导致植株死亡[6,8].

为了阐明水稻耐盐的遗传机制，筛选耐盐或盐敏感水稻突变体、克隆其相关基因已经成为挖掘水稻耐盐新基因的有效策略[9].迄今，多个与水稻耐盐性相关的QTL已被定位，但目前仅有少数耐盐性相关QTL被克隆.已知的水稻耐盐相关基因来自不同代谢途径，在不同的组织器官中受盐胁迫诱导差异表达[10].这些耐盐相关基因可以分为：转运蛋白编码基因[11]、转录因子[12]、酶编码基因[13]、MicroRNA编码基因[14]以及其他功能蛋白编码基因[15].其中，钠离子转运蛋白HKT在维持植物体内K+、Na+平衡中起着重要作用，其过量表达可以提高植物的抗盐性[10]；此外，在盐胁迫下，MYB转录因子过量表达可提高植株对盐胁迫的耐受性[16].

水稻对盐胁迫的耐受性是受多种因素共同调控的，涉及生理、生化、细胞等多方面的响应[17]，这些因素之间的相互作用机理目前仍不清楚.本研究通过对水稻甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变的突变体库进行盐胁迫处理，筛选获得了1个水稻盐敏感突变体，命名为ssm1(salt sensitive mutant 1),该突变体在盐胁迫条件下叶片发生明显卷曲，衰老加速、死亡，此外，ssm1还具有叶片早衰表型.通过高温(45 ℃)、低温(4 ℃)、干旱(20% PEG)和盐(1% NaCl)胁迫处理，发现ssm1对盐表现出专一敏感性.本研究通过盐处理前后，ssm1突变体的体内生理变化，探究SSM1参与水稻盐胁迫耐受分子机理，为指导育种实践提供重要的理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究使用的水稻材料为蜀恢527(野生型，WT)和ssm1盐敏感突变体.其中，ssm1是水稻品种蜀恢527经EMS诱变处理获得，经连续多代自交，突变性状遗传稳定.

种子浸种置于30 ℃恒温箱，3～4 d后将发芽的水稻种子播种于人工气候室中.人工气候室的培养条件为：恒温30 ℃，光照及黑暗时间分为14 h/10 h，光照强度为50～100 μmol·m-2·s-1.营养液母液配方见表1(使用过程中需要稀释至1×使用).

表1 营养液母液配方Tab.1 Rice nutrient solution formula

1.2 实验方法

1.2.1 胁迫处理

选取生长状况良好两周的水稻幼苗，分别于45 ℃恒温培养箱中进行高温胁迫处理48 h，4 ℃恒温培养箱中进行低温胁迫处理48 h，含20% PEG营养液中进行干旱处理24 h以及含1% NaCl营养液中进行盐胁迫处理24 h，对比分析野生型和突变体生长状态和生理指标差异.

1.2.2 H2O2含量分析(DAB染色)

利用DAB染色分析1% NaCl处理前后WT和ssm1突变体叶片中H2O2含量.染色液配制：取50 mg的DAB，加入45 mL的水，搅拌均匀使之完全溶解，然后用0.2 M的盐酸调节pH至3.0后，加入25 μL的吐温20，再加入2.5 mL 0.2 M的Na2HPO4，搅拌均匀，加H2O至50 mL.盐胁迫处理前后的新鲜叶片完全浸没于DAB染色液中，真空泵中缓慢抽真空，2次，每次5 min，避光染色12 h后置于脱色液(V乙醇∶V乙酸∶V甘油= 3∶3∶1)中脱色.

1.2.3 MDA和T-AOC测定

水稻生长至四叶期后，选取生长状况良好且均一的水稻WT和ssm1突变体置于含1% NaCl的营养液中处理 0、1、24 h，取新鲜叶片用于丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)测定，试剂盒购买于Solarbio生物技术公司(BC0025 和 BC1310).T-AOC测定原理：在酸性环境下，还原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力.我们利用分光光度计测定Fe2+-TPTZ 的颜色吸光度大小来反映总抗氧化能力的多少.取0.1 g新鲜叶片置于1 mL磷酸缓冲液(50 μmol/L,pH 7.0)中研磨成匀浆，8 000 g 离心10 min，上清在波长593 nm下测定T-AOC的吸光度，在波长532 nm 和600 nm下测定MDA的吸光度.

1.2.4 耐盐相关基因表达量测定

取盐处理 0、1、6 h 野生型和ssm1突变体水稻叶片样品各 0.1 g，液氮迅速冷冻置于-80 ℃冰箱，保存备用.采用 Trizol 法(康为世纪)提取水稻总RNA，NanoDropTM2000测定浓度，利用反转录试剂盒 PrimeScriptTMII1st Strand cDNASythesis Kit(Takara)进行反转录.选取耐盐相关基因OsHKT1;1和OsMYB2，通过实时荧光定量PCR检测盐处理前后WT和ssm1中相对表达量.分别以WT和ssm1的cDNA为模板，以Actin为内参，反应体系(10 μL)∶cDNA template 1 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，3个重复，在荧光定量PCR仪(Bio Rad CFX96)上反应，反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环.

表达量计算公式：

ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test),

ΔCT(calibrator)=CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator),

ΔΔCT=ΔCT(test)-ΔCT(calibrator), 2-ΔΔCT=表达量比值.

引物见表2.

表2 相关基因引物Tab.2 Related primers in this study

2 结果与分析

2.1 ssm1突变体筛选

利用EMS处理野生型水稻，我们共获得了含5 000份材料的水稻突变体库.通过对该突变体库进行盐胁迫处理，获得了多个盐耐受性改变的材料，其中一个命名为ssm1.研究发现，在1%盐浓度胁迫处理后，突变体ssm1几乎全部枯黄致死，而野生型只有部分叶片枯黄(图1b).ssm1突变体存活率不足6%，而野生型植株存活率为92%.上述结果表明，与野生型相比，ssm1突变体对盐胁迫敏感.

a:野生型和ssm1突变体2周苗表型; b:野生型和ssm1突变体1% NaCl胁迫处理10 d后表型;c:统计分析盐胁迫处理10 d后野生型和ssm1突变体存活率.Bar=2 cm.

2.2 ssm1突变体表型分析

进一步研究发现，在四叶期时ssm1突变体叶片表现出黄色条斑表型(图2a和b)，并持续至整个生命周期(图2c和d)；而且伴随叶片衰老，植株也出现株高变矮表型(图2c).说明ssm1不仅参与植物盐胁迫调控和叶片衰老，同时影响植株的生长发育.

a:WT和ssm1四叶期表型; b:WT和ssm1四叶期叶片表型; c:WT和ssm1分蘖期植株表型;d:WT和ssm1分蘖期叶片表型.

2.3 盐胁迫影响ssm1突变体叶片中H2O2积累

图3 盐胁迫影响ssm1突变体叶片中H2O2积累Fig.3 Salt stress affects H2O2 accumulation in ssm1 mutant leaves

胁迫能引起水稻活性氧的积累，造成水稻植株氧化损伤，影响植株正常的生长和发育，甚至导致植株死亡[20].DAB染色是一种简单有效的定性测定H2O2含量的方法，已被广泛应用于水稻[21]和小麦[22]等农作物研究.为探寻ssm1突变体在盐胁迫条件下叶片中H2O2积累的情况，我们对盐处理不同时期的野生型和ssm1突变体叶片进行了DAB染色分析.结果发现，盐胁迫处理前突变体中H2O2含量高于野生型(图3a).此外，尽管盐胁迫处理后均引起野生型和突变体叶片中H2O2积累，但是在ssm1突变体中H2O2的积累量显著高于野生型(图3b、c和d).说明盐胁迫影响ssm1突变体叶片中H2O2的积累.

2.4 盐胁迫影响ssm1突变体MDA积累和总抗氧化能力

MDA是植物细胞膜质过氧化程度的重要指标之一，较高的MDA含量说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到伤害，同时也降低了植物的耐盐性[23].因此我们对盐处理前后叶片中的MDA含量进行了测定(图4a).结果显示，无论是盐处理前后(0和24 h)，ssm1叶片中MDA积累量以及上升速率显著高于野生型，说明ssm1叶片中细胞膜质过氧化程度高于野生型，且随着盐胁迫时间的增加而加剧，该结果与盐胁迫处理后ssm1突变体中H2O2含量显著高于野生型的结果相符.此外，对盐处理前后水稻叶片中总抗氧化能力测定(图4b)发现，盐处理24 h后野生型和突变体总抗氧化能力均低于处理前，无论是盐胁迫处理前还是盐处理后野生型总抗氧化能力均显著高于ssm1突变体，推测盐胁迫处理前期由于植株应激反应引起植株总抗氧化能力的提高，但随着胁迫程度的加深总抗氧化能力随之降低[7].

a:WT和ssm1突变体MDA的含量; b:WT和ssm1突变体T-AOC.

2.5 盐胁迫影响ssm1叶片中耐盐相关基因的表达

为探究盐胁迫对ssm1叶片中耐盐相关基因表达量的影响，利用qRT-PCR对盐胁迫前后野生型和ssm1突变体叶片中OsMYB2和OsHKT;1的表达量进行了检测.结果显示，在盐胁迫处理前，ssm1突变体叶片中OsMYB2和OsHKT;1的表达量均显著高于野生型，由此可以推测，与野生型相比，水稻ssm1突变体在盐胁迫处理前可能就处于一种胁迫状态.盐处理1 h后这两个基因在野生型和ssm1突变体中的表达量均上调，但此时ssm1中的表达量却低于野生型，尤其是OsMYB2在ssm1中的表达量，仅为野生型的1/2.随着盐胁迫处理时间的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突变体中的表达量下调，此时OsHKT;1在ssm1突变体中的表达量为野生型的2/3，OsMYB2在ssm1突变体中的表达量已不足野生型的1/20(图5).这些耐盐基因表达模式的改变，可能是ssm1突变体对盐敏感的主要原因.

图5 盐胁迫影响ssm1突变体叶片中耐盐相关基因的表达Fig.5 Salt stress affects the relative expression of salt tolerance related-genes in ssm1 mutant leaves

3 讨论

植物在正常的生长条件下，体内酶和非酶系统使活性氧的产生和清除维持在一个动态平衡之中，然而，在盐胁迫下，这种动态平衡被打破，体内的活性氧迅速产生并积累，对植物的生长产生强烈的破坏作用[24].本研究通过对EMS诱变的种库进行盐敏感性材料筛选获得了一个盐敏感突变体ssm1.此外，进一步研究发现ssm1突变体具有早衰表型(图2)，因此SSM1不仅参与盐胁迫调控，且调控植株的生长发育.

DAB染色是定性检测过氧化氢含量的有效手段之一[25]，对盐胁迫处理前后的野生型和突变体叶片进行DAB染色，结果显示盐胁迫处理后突变体中过氧化氢积累量以及积累速率显著高于野生型(图3)，过高的过氧化氢积累可能是引起突变体对盐胁迫敏感的原因之一.MDA含量和总抗氧化能力检测结果表明，盐胁迫处理后突变体叶片中MDA的含量显著高于野生型(图4)，且此时突变体的总抗氧化能力也显著低于野生型(图4)，该结果与H2O2的结果相符(图3).以往研究表明，植物体内积累的过氧化氢和MDA可能是由于抗氧化物酶系统紊乱引起的[26].在水稻ssm1突变体中抗氧化物酶活性的紊乱导致植株积累大量的过氧化氢和MDA，活性氧的积累引起膜脂质氧化程度高，导致膜透性改变、抗氧化能力下降，促使植物细胞死亡.

植物对盐胁迫的应答过程中发生的一系列生理生化变化，是复杂的内在分子机制调控的结果.水稻中存在许多盐胁迫相关的基因，如MYB2[16]、SOS1[27]、SOS2[27]和HKT1[28]，这些基因在盐胁迫条件下起着重要作用.OsMYB2是MYB基因家族中编码R2R3型MYB转录因子的基因[16]，该转录因子在水稻响应盐胁迫的过程中起重要的调节作用[26]；OsHKT;1是HKT基因家族水稻OsHKT;1钠转运体的基因，该钠转运体参与提高水稻耐盐性[10].在盐胁迫处理前，OsMYB2和OsHKT;1在突变体中的表达量略高于野生型，这可能是由于突变体已处于胁迫状态，OsMYB2和OsHKT;1基因上调表达参与胁迫调控.随着处理时间的增加，在盐胁迫处理时间2 h左右，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和突变体中的相对表达量比处理0 h时均有所上升，说明盐胁迫处理后，野生型和突变体中OsMYB2和OsHKT;1均上调表达参与盐胁迫响应，然而野生型增长速率显著高于ssm1突变体，且野生型的表达量略高于突变体，说明突变体在盐处理条件下的胁迫响应能力低于野生型.然而随着盐胁迫处理时间的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突变体中的表达量均下调且突变体中的表达量显著低于野生型.由此可以推测，与野生型相比，突变体中钠转运体表达量的降低可能引起大量Na+进入细胞，耐盐相关基因的下调表达可能是引起植株盐耐受性下降的重要原因.

综上所述，SSM1基因的突变，导致在盐胁迫条件下，ssm1突变中过氧化氢和MDA大量积累，活性氧的积累进而引起膜透性改变、植株抗氧化能力降低，并造成钠转运体基因表达量下调，外源的Na+大量进入细胞，导致细胞死亡.