李万奎,石春健
(1.河南圣德医院 神经内科,河南 信阳 464000;2.信阳职业技术学院 医学部,河南 信阳 464000)
脑卒中具有较高的致残率、死亡率及复发率,已成为我国居民第一位的死亡原因[1],其中缺血性脑血管疾病占脑卒中的60%~70%,严重危害人民身体健康。随着目前诊疗技术的提高,通过静脉或动脉溶栓及机械开通,已成为挽救缺血脑组织的重要措施之一,可在很大程度上促进缺血性脑血管疾病神经功能的恢复[2],但缺血再灌注损伤却是其不可避免的并发症。研究表明,缺血再灌注可引起血管内皮细胞损伤,导致其形态和功能发生变化[3],而内皮细胞功能损伤是心脑血管疾病的早期病理变化基础[4]。细胞受损后引发的氧化应激亦起重要作用,可触发一系列级联反应,最终导致神经细胞死亡和神经功能障碍[5]。
阿托伐他汀钙是临床治疗及预防缺血性脑血管疾病的一线药物,不仅能降低血脂,稳定斑块,而且能改善血管内皮功能和抗氧化应激[6]。本研究通过缺血再灌注制作人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazoliun,MTT)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力测定反应细胞的增殖活力及损伤程度,检测上清液丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)来分析各组HUVEC氧化应激状态,探讨阿托伐他汀钙对缺血再灌注诱导HUVEC损伤和氧化应激的影响。
1.1 实验资料
1.1.1药物 阿托伐他汀钙标准品购自中国药品生物制品检定所。
1.1.2试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司,胰蛋白酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,LDH、MDA、T-AOC、SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.1.3实验对象 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠12只,雌雄不限,体质量为250~300 g,许可证号为SCXK(豫)2017-0001,由信阳职业技术学院实验动物中心提供,购自河南省实验动物中心。本研究方案由河南省实验动物中心实验动物伦理委员会审查和批准,所有试验均遵照GB 14925-2010《实验动物环境及设施》,遵守实验动物福利与伦理原则。脐带数根,来自河南圣德医院妇产科,所有脐带均经过孕妇及家属知情同意。
1.2 实验方法
1.2.1HUVEC的培养、鉴定及传代 依据文献方法[7]及本人前期研究,无菌条件下将健康产妇脐带的静脉内血液冲洗干净,注入提前预热37 ℃,2.5 g·L-1的胰蛋白酶,置于37 ℃环境孵育10 min,收集消化液与冲洗液,终止消化后离心,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,接种于100 mL培养瓶,置于体积分数为5%的CO2、37 ℃培养箱中培养。培养成功的HUVEC经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定证实培养的细胞为内皮细胞。将HUVEC进行传代,采用生长良好的3~4代细胞进行试验研究。
1.2.2含药血清制备 健康成年SD大鼠12只,以随机数表法分为阿托伐他汀钙高剂量组、阿托伐他汀钙低剂量组、缺氧模型组及空白对照组,每组3只。模拟人类用药方法及参考相关文献[8],阿托伐他汀钙高剂量组大鼠3只均以0.1 g·L-1阿托伐他汀钙溶液2 mL灌胃,阿托伐他汀钙低剂量组大鼠3只均以0.05 g·L-1阿托伐他汀钙溶液2 mL灌胃,缺氧模型组及空白对照组各3只以蒸馏水2 mL灌胃。所有大鼠均灌胃3 d,于最后一次给药后2 h无菌条件下取腹主动脉血,将同一组血液混合,离心分离血清,经56 ℃灭活30 min,用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,置-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.3模拟缺血再灌注模型的制作 按照文献[9]的方法改进,制作模拟缺血再灌注模型,将培养液换成无糖DMEM培养基,置于缺氧环境(体积分数为5%的CO2和体积分数为95%的N2,37 ℃)30 min后,再换成普通培养基,恢复常氧环境(体积分数为5%的CO2和空气,37 ℃)培养4 h。
1.2.4实验分组及处理 取生长良好的传代培养的HUVEC,将细胞分为4组,分别为空白对照组、缺氧模型组、阿托伐他汀钙高剂量组、阿托伐他汀钙低剂量组。每组重复10个复孔。分别给予阿托伐他汀钙高低剂量组口服相应剂量药物大鼠血清的DMEM培养液,给予空白对照组和缺氧模型组未给药物大鼠血清的DMEM培养液,培养24 h。弃去培养基,除空白对照组外(给予DMEM培养液常氧培养),再给予各组无糖DMEM培养基缺氧培养30 min,换普通DMEM培养液再常氧培养4 h,进行相关指标检测。实验重复3次。
1.3 观察指标
1.3.1MTT法测定细胞增殖活力 处理完各组HUVEC后,加入MTT(5 g·L-1)20 μL,继续孵育4 h,终止培养后吸去孔内培养液,每孔加入二甲基亚砜150 μL,低速震荡10 min,在酶联免疫检测仪490 nm测量各孔吸光值,结果以光密度(optical density,OD)值表示。
1.3.2LDH外漏的测定 处理完各组HUVEC后,取出培养的细胞,吸取各组培养液,按LDH测定试剂盒说明书方法测定LDH的活性。
1.3.3氧化应激指标的检测 处理完各组HUVEC后,取出培养的细胞,吸取各组培养液,分别按MDA、SOD及T-AOC测定试剂盒说明书方法测定MDA水平、SOD的活性及T-AOC水平。
2.1 对增殖活力及LDH外漏的影响缺氧模型组OD值低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),LDH外漏高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。阿托伐他汀钙高、低剂量组OD值高于缺氧模型组,差异有统计学意义(均P<0.05),LDH外漏低于缺氧模型组,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
表1 阿托伐他汀钙对缺血再灌注诱导损伤的HUVEC增殖活力及LDH外漏的影响
2.2 对氧化应激指标的影响缺氧模型组MDA水平高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);SOD活性低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);T-AOC低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。阿托伐他汀钙高、低剂量组MDA水平低于缺氧模型组,差异有统计学意义(均P<0.05);SOD活性高于缺氧模型组,差异有统计学意义(均P<0.05);T-AOC高于缺氧模型组,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。
表2 阿托伐他汀钙对缺血再灌注诱导损伤的HUVEC氧化应激指标的影响
脑缺血再灌注后会损伤血管内皮细胞结构和功能,并可产生过多的氧自由基,进一步加重脑缺血病理改变。宋宁等[10]研究发现,缺血再灌注大鼠脑组织MDA水平升高,SOD活力降低,提示脑缺血再灌注可激活体内氧化应激反应,造成脑组织损伤。阿托伐他汀钙可较好地保护血管内皮细胞及抗氧化,有效地阻断氧化应激级联反应,减少分子和细胞的损伤[11]。阿托伐他汀钙对缺血性卒中具有调脂以外的抗氧化应激作用,对改善急性缺血性卒中患者的预后具有重要作用[12]。
研究表明,血管内皮细胞是缺血再灌注损伤中重要的靶细胞,是损伤的始发因素[13]。缺血再灌注后,氧自由基通过损伤内皮细胞膜,引起脂质过氧化和级联反应,蛋白质和核酸变性,细胞转运功能和酶的功能改变,引起内皮细胞损伤[14]。MTT法是检测细胞损伤程度的常用方法,作用于活细胞线粒体中的呼吸链,其OD值可反映细胞的增殖活力[15]。LDH是机体能量代谢中重要的酶,在细胞膜完整性破坏、通透性增加时,通过检测细胞培养液中LDH活性,可反映细胞膜损伤程度[16]。MDA是氧自由基攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸的最终产物,其水平可反映机体内脂质过氧化的程度[17]。T-AOC是机体内总抗氧化体系的总称,可分为酶促防御系统及非酶促防御系统[18]。SOD是酶促防御系统中最重要的一种,是生物体内专一清除超氧阴离子的特异性抗氧化酶[19]。因此,T-AOC及SOD活力的高低可反映机体抗氧化能力。
本研究发现,缺氧模型组HUVEC的OD值降低,LDH外漏升高,MDA水平升高,SOD活性降低,T-AOC降低,说明缺血再灌注损伤抑制了血管内皮细胞的增殖活力,增加了血管内皮细胞损伤程度,激活了体内氧化应激反应。王红芹等[20]研究发现,体外培养HUVEC缺氧复氧后,细胞活性下降,细胞内MDA、活性氧增多,LDH漏出率增高,与本研究一致。而阿托伐他汀钙高、低剂量组HUVEC的OD值升高,LDH外漏不同程度降低,MDA水平不同程度降低,SOD活性及T-AOC不同程度升高,上述作用随药物剂量增加呈增强趋势。这说明阿托伐他汀钙可改善缺血再灌注损伤细胞的增殖活力,减轻细胞的损伤程度,降低氧自由基的损伤,提高抗氧化能力,从而有效地保护缺血再灌注后内皮细胞结构和功能。