肺腺癌转移相关转录本1调控喉癌细胞的增殖和侵袭*

阳志慧，王少新，晋 舒，刘 勇，宋 鑫，鲁云杰

1.四川省资阳市第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科(资阳 641300)；2.四川省肿瘤医院 头颈外科 (成都 610041)

随着经济发展、生活水平提高和随之而来的环境污染，癌症患病率越来越高，也越发引起了人们的关注和重视。喉癌(laryngeal cancer,LC)是耳鼻喉科中的主要恶性肿瘤疾病之一，由于吸烟、喝酒易发LC，所以易患于男性群体[1]。LC细胞作为一种具有强大自我更新能力的细胞，拥有高度迁移、浸润和转移能力[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一类存在于真核细胞由RNA聚合酶Ⅱ转录的没有蛋白编码能力的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)，可靶向调控微小RNA (microRNA, miR)和蛋白编码基因的表达[3]。

肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)位于染色体11q13位点上，是一种在细胞代谢过程中广泛表达的LncRNA。MALAT1能够诱导癌细胞增殖[4]，高度参与RNA加工、基因转录、核糖体蛋白、蛋白质降解和代谢调节[5]。MALAT1在很多癌症中高表达，敲除MALAT1，能够抑制结肠直肠癌[6]、喉鳞癌[7]、非小细胞肺癌[8]等癌细胞的增殖，但在LC中未曾提及。本课题拟对MALAT1对LC细胞增殖和侵袭的作用以及潜在的分子机制进行研究，旨在为LC的治疗提供理论依据和研究意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人二倍体细胞系(WI-38)和喉癌细胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8)购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。

1.1.2 试剂 Trizol Invitrogen(上海源叶生物科技有限公司，S30876-100 mL)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco，DXT-10099141)；达尔贝科极限必需培养液(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)(武汉塞默飞生命科技有限公司，PM150210)；lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen，11668019)；LncRNA-MALAT1、短发夹RNA(short hairpin RNA，sh-RNA)、sh-MALAT1及其阴性对照(sh-MALAT1 negative control，sh-MALAT1-NC)、miR-503-5p模拟物(miR-503-5p mimic)、miR-503-5p抑制剂(miR-503-5p inhibitor)及阴性对照序列(广州锐博生物科技有限公司)；Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E1910)；实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)/TaqMan One Step qRT-PCR Kit(Solarbio，T2210)；细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8，CCK8)(江莱生物，48T/96T)；侵袭小室(Transwell)(Corning，FK-Ik019)。

1.1.3 仪器 净化工作台(Boxun，SW-CJ-2FD)；生物显微镜(Olympus，BX43)；恒温培养箱(Daihan，WIG-105)；倒置荧光显微镜(Nikon，Ti2系列)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 在无菌超净台中，将WI-38、TU212、Hep2和AMC-HN-8细胞接种在含10% FBS和DMEM(高糖)的培养皿，37 ℃、5%CO2的恒温培养箱培养，48～72 h后换液，进行细胞传代，取对数期生长旺盛的细胞进行后续实验研究。转染时，6孔板中细胞密度融合到70%～80%时效果最佳。根据lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen)说明书，sh-MALAT1与miR-503-5p inhibitor单独或联合转染Hep2细胞。

1.2.2 qRT-PCR检测基因表达 转染后24 h内收集细胞，并加入Trizol试剂提取人二倍体细胞系和LC细胞系中的总RNA。按照TaqMan One Step qRT-PCR Kit说明书，将总RNA逆转录为cDNA，再进行qRT-PCR。利用Primer Premier 6.0，根据每个基因序列设计引物，分别为：MALAT1 (正向引物5′- GAATTGCGTCATTTAAGCCTA GTT -3′，反向引物5′- GTTTCATCCTACCACTC CCAATTAAT-3′)；miR-503-5p (正向引物5′-GA AGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物5′-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3′)；叉头盒蛋白K1(forkhead box K1，FOXK1) (正向引物5′ -GCCTC CTTGACAATACCGCT-3′，反向引物 5′ -TTCCA AACCCTCCCTCTGGT-3′)。根据荧光定量，计算所有样品和标准品的循环数(cycle threshold, CT)。基于该标准的CT值，绘制标准曲线，然后使用2-ΔΔCT方法进行定量计算。

1.2.3 确定MALAT1、miRNA和mRNA的靶向关系 使用生物信息学软件StarBase和TargetScan对MALAT1、miR-503-5p和FOXK1靶向关系分别进行预测和分析。用Dual-Luciferase Reporter Assay System进一步验证靶向关系。用PCR扩增含有miR-503-5p结合位点的MALAT1基因的3′-UTR序列，将MALAT1的3′-UTR克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体pMIR-MALAT1-wild type中。通过PCR扩增MALAT1 5′-GAATTGCGTC ATTTAAAGCCTAGTT-3′的3′-UTR结合位点的突变，并克隆到pMIR-MALAT1-mutant质粒中。根据lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen)说明书，将miR模拟物(miR mimic)和荧光素酶质粒pMIR-MALAT1(野生型/突变型，WT/MUT)转染到Hep2细胞中。转染48 h后，弃去旧培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗细胞2次。随后，在每孔细胞中加入100 μL裂解缓冲液(passive lysis buffer, PLB)，室温下轻轻震荡15 min，收集细胞裂解液。取20 μL PLB加入发光板中，用GloMax生物发光检测仪读取背景值2 s，每个样品加入100 μL荧光素酶分析试剂Ⅱ(luciferase assay reagent Ⅱ，LAR Ⅱ)工作液，快速混匀，读值2 s。读值完毕后，每个样品再加入100 μL Stop&GloTM试剂，快速混匀后，放入发光板中检测，读值2 s。以上实验，每个样品重复3次，记录和保存所有结果及数据，荧光显微镜不可在30 min内连续开启关闭。

1.2.4 CCK8法检测LC细胞增殖情况 将对照组、sh-MALAT1组、miR-503-5p inhibitor组和联合转染(sh-MALAT1+miR-503-5p inhibitor)组细胞分别接种于96孔板(1×105个/孔)，每组设置6个重复孔。37 ℃恒温培养箱孵育，每孔加入10 μL CCK8(0.5 g/L)溶液培养4 h，完成培养。在0、1、2、3、4 d分别于酶标仪上测定波长在450 nm处各孔细胞的光密度(optical density, OD)值。

1.2.5 蛋白质印迹技术(Western blot)检测相关蛋白表达情况 将细胞中加入放射免疫沉淀(radioimmuneprecipitation,RIPA) PLB，放置于冰上15～30 min使细胞溶解，然后用超声裂解法5 s，4次，使细胞裂解，最后4 ℃，离心半径10 cm，离心速度3 000 r/min， 离心15 min。结束后，将上清液移入新EP管。提取的蛋白采用双肌球蛋白酸(bicinchoninic acid,BCA)法定量，储存于-20 ℃冰箱。分离蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，半干转录，100 mA，1.5 h，用5%脱脂奶粉封膜2 h。将稀释的增殖抗原Ki67 (1∶1 000)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(1∶1 000)、FOXK1 (1∶1 000)、β-肌动蛋白(β-actin)(1∶1 000)单抗在膜上孵育，4 ℃过夜。用PBST(PBS中加入Tween-20)洗涤后，加入相应二抗，孵育30 min，再次用PBST洗涤。采用化学发光法和X线照射成像法观察结果。最后用Protein图像处理软件和Quantity one软件分别扫描X-胶片和条带密度测量值。蛋白表达水平相对于β-actin表示。本实验重复3次。

1.2.6 Transwell染色检测LC细胞侵袭情况 根据试剂盒说明书，用200 μL无血清DMEM换液，24 h后，在Transwell的底部、膜上，按1∶5比例涂抹50 mg/L的基质凝胶稀释液，4 ℃风干。100 μL肿瘤细胞悬液中加入500 μL的含有10%FBS的DMEM培养基和200 μL无血清DMEM，将混合液注入Transwell的内外，每组实验在24孔板中重复3次，对照组在无基质的Transwell中培养。培养48 h后，用PBS冲洗Transwell，移去膜上的细胞，用4%甲醇固定。最后用Giemsa染色，自然风干后观察微孔膜下层的细胞。本实验重复3次。

1.2.7 克隆形成实验检测LC细胞增殖情况 取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10% FBS的DMEM培养液中备用。将适当密度的细胞接种于培养皿中并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中静置培养2～3 d，弃去上清液，用PBS小心清洗2次。将1 mL 4%甲醇固定15 min，然后去固定液，加适量Giemsa染色液染色15 min，最后用纯水缓慢洗去Giemsa染色液，自然风干，用生物显微镜观察、拍照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人二倍体、LC细胞系中MALAT1和miR-503-5p表达水平

qRT-PCR检测结果显示，人二倍体细胞系(WI-38) MALAT1表达水平为(1.00±0.13)，LC细胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) MALAT1表达水平分别为(2.44±0.32)、(3.61±0.24)和(2.80±0.18)，LC细胞系中MALAT1的表达水平高于人二倍体细胞系(P<0.05)；人二倍体细胞系(WI-38) miR-503-5p表达水平为(1.00±0.12)，LC细胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) miR-503-5p表达水平分别为(0.62±0.08)、(0.37±0.10)和(0.50±0.11)，LC细胞中miR-503-5p的表达低于WI-38(P<0.05)。结果表明，在LC细胞中，MALAT1高表达，miR-503-5p低表达。由于Hep2细胞中MALAT1和miR-503-5p的变化最明显，因此后续采用Hep2细胞进行研究(图1)。

2.2 MALAT1和miR-503-5p的靶向关系

通过生物信息学软件StarBase对MALAT1和miR-503-5p的靶向关系进行预测和分析，发现miR-503-5p区域存在LncRNA的潜在结合位点，说明miR-503-5p是MALAT1的靶向调节基因之一。qRT-PCR检测发现：对照组、sh-NC组、sh-MALAT1组MALAT1表达分别为(1.00±0.10)、(0.93±0.12)、(0.13±0.05)，对照组、NC inhibitor 组、miR-503-5p inhibitor 组miR-503-5p表达分别为(1.00±0.12)、(0.99±0.20)、(0.08±0.03)，证明MALAT1和miR-503-5p能够成功在LC细胞中被敲除。对照组、sh-MALAT1组、miR-503-5p inhibitor组、sh-MALAT1+ inhibitor组miR-503-5p表达分别为(0.37±0.10)、(2.86±0.11)、(0.08±0.03)、(0.41±0.08)，敲除MALAT1可以明显增加miR-503-5p的表达水平，说明MALAT1和miR-503-5p为负调控靶向关系。对照组、NC mimic组、miR-503-5p mimic组miR-503-5p的表达水平分别为(1.00±0.12)、(1.01±0.20)、(43.60±6.08)，miR-503-5p mimic组miR-503-5p的表达水平相比对照组增加了40多倍(P<0.001)，证明过表达miR-503-5p可以大幅度增加miR-503-5p的表达水平。用双荧光素酶报告进行进一步验证MALAT1和miR-503-5p的靶向关系，NC mimic+ MALAT1 WT组、miR-503-5p mimic+ MALAT1 WT组、NC mimic+ MALAT1 MUT组、miR-503-5p mimic+MALAT1 MUT组荧光素酶活性分别为(3.31±0.30)、(1.72±0.21)、(3.28±0.27)、(3.44±0.22)，miR-503-5p mimic和野生型MALAT1共转染Hep2细胞后，细胞中双荧光素酶活性明显低于突变型(P<0.05)，说明MALAT1与miR-503-5p之间一定存在着靶向关系。因此，miR-503-5p是MALAT1的靶向调节基因之一，且miR-503-5p受MALAT1的负调控作用(图2)。

2.3 敲除MALAT1对LC细胞增殖的影响

CCK8检测结果所示，随着时间增长，各组细胞增殖差异逐渐明显。在第4天，对照组、sh-MALAT1组、miR-503-5p inhibitor组、sh-MALAT1+inhibitor组细胞增殖倍数分别是(6.80±0.40)、(2.55±0.35)、(8.26±0.36)、(6.11±0.37)倍，敲除MALAT1可以降低LC细胞的增殖倍数(P<0.01)，miR-503-5p inhibitor组细胞增殖倍数明显高于联合转染组(P<0.01)，说明miR-503-5p inhibitor逆转了sh-MALAT1对LC细胞增殖的抑制作用。Western blot检测结果显示，对照组、sh-MALAT1组、miR-503-5p inhibitor组、sh-MALAT1+inhibitor组Ki67蛋白表达分别为(0.58±0.10)、(0.15±0.04)、(0.95±0.13)、(0.66±0.08)，PCNA蛋白表达分别为(0.43±0.08)、(0.09±0.03)、(0.73±0.07)、(0.54±0.10)，sh-MALAT1组相关蛋白(Ki67和PCNA)的表达水平降低(P<0.05)；miR-503-5p inhibitor组的相关蛋白表达水平却明显增加，而联合转染组相关蛋白表达水平明显低于miR-503-5p inhibitor组(P<0.01)，说明miR-503-5p抑制剂逆转了sh-MALAT1对相关蛋白表达的抑制作用。这些结果显示，敲除MALAT1能够抑制LC细胞的增殖和相关蛋白的表达，miR-503-5p抑制剂能够逆转sh-MALAT1对LC细胞增殖的抑制作用(图3)。

2.4 敲除MALAT1对LC细胞侵袭能力的影响

从Transwell检测结果可知，对照组、sh-MALAT1组、miR-503-5p inhibitor组、sh-MALAT1+ inhibitor组细胞侵袭数目分别为(86.45±7.12)、(31.19±4.28)、(138.26±10.13)、(95.21±9.13)个，与对照组比较，sh-MALAT1组LC细胞的侵袭数明显降低(P<0.01)，miR-503-5p inhibitor组LC细胞侵袭数明显增加(P<0.01)；与联合转染组相比，miR-503-5p inhibitor组有所降低(P<0.01)。结果说明，敲除MALAT1能够抑制LC细胞的侵袭，miR-503-5p inhibitor能够逆转sh-MALAT1对LC细胞侵袭的抑制作用(图4)。

2.5 MALAT1通过靶向miR-503-5p上调FOXK1对LC细胞增殖和侵袭的影响

通过生物信息学软件TargetScan对miR-503-5p和FOXK1的靶向关系进行分析，结果显示，FOXK1 3′-UTR的5062-5068 bp区域存在has-miR-503-5p的潜在结合位点，故FOXK1是miR-503-5p的靶向调节基因之一。继而用qRT-PCR检测人二倍体细胞系和LC细胞系中FOXK1的表达水平，结果显示，人二倍体细胞系(WI-38) FOXK1表达水平为(1.00±0.13)，LC细胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) FOXK1表达水平分别为(2.13±0.31)、(2.86±0.25)、(1.96±0.17)，FOXK1在LC细胞中高表达，且Hep2细胞中FOXK1的变化最为明显，因此，采用Hep2细胞进行后续研究。进一步用Western blot、Transwell、克隆形成分析显示，对照组、sh-MALAT1组、pLenti-CMV-FOXK1组、sh-MALAT1+FOXK1组FOXK1蛋白表达水平分别为(2.86±0.24)、(0.34±0.08)、(5.81±0.20)、(4.11±0.17)，侵袭细胞数目分别为(76.32±10.01)、(37.22±7.14)、(133.64±11.24)、(90.52±12.29)个，克隆形成细胞数目分别为(867.34±35.28)、(522.63±41.62)、(1 138.87±46.75)、(905.57±28.35)个，敲除MALAT1后FOXK1的表达水平随之降低，LC细胞的侵袭数和增殖数也随之减少；过表达FOXK1后LC细胞的侵袭和增殖能力增加，并可以明显逆转sh-MALAT1对LC细胞的抑制作用。过表达FOXK1能够促进LC细胞增殖，并能逆转sh-MALAT1对LC细胞增殖和侵袭的抑制作用。MALAT1通过靶向miR-503-5p上调FOXK1能够促进LC细胞的增殖和侵袭(图5)。

3 讨论

LC是喉部的恶性肿瘤，发病率约占全身肿瘤的1%～5%，LC导致人吞咽困难，影响呼吸和说话，严重者可致人窒息而亡。由于其治疗手段单一，治愈率不高，以至于严重影响人类的健康，是目前亟待解决的一个重大难题。因此，寻找多层面调控LC细胞增殖和转移相关的异常基因表达、信号通路及其分子机制，将有助于识别潜在的LC靶点，为临床提供新的治疗策略。

MALAT1是较早发现与人类疾病相关的LncRNA之一，在不同的哺乳动物中均有丰富的表达，而且在各种癌症的发展和进展过程中发挥着关键作用[9]。已有研究[6,8,10]显示，MALAT1在肿瘤组织系、卵巢癌细胞系中上调，在直肠癌、结肠癌、肺癌、喉鳞癌等癌症中也被多次提及，MALAT1高表达可以促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制癌细胞凋亡，这些研究证明MALAT1在多种癌症中为一种致癌因子。在此基础上，本研究对LC细胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8细胞)和人二倍体细胞系(WI-38细胞)中MALAT1的表达水平进行了qRT-PCR检测，结果显示，MALAT1在LC细胞中高表达，继而设计sh-RNA对MALAT1进行敲除，结果显示，敲除MALAT1可以明显抑制LC细胞的增殖和侵袭。这说明在LC中MALAT1也为一个致癌因子，这与MALAT1在其他癌症中的研究[6,8]结果相似。

miRNA是单链非编码小RNA，是转录的主调控因子，影响细胞新陈代谢、衰老[11]和骨细胞分化[12-13]。miR-503-5p作为一种成熟的miRNA，由pre-miR-503的5′端衍生而来，是神经母细胞瘤中ALK表达的调控因子[14]。研究[15-21]发现，miR-503-5p过表达能够抑制膀胱癌细胞的增殖、老年痴呆症神经元的凋亡和炎症、宫颈癌细胞的迁移和侵袭、骨肉瘤细胞的转移和增殖、调控细胞的衰老。然而，目前关于miR-503-5p在LC方面的报道却鲜少未见。在此基础上，本研究对LC细胞系和人二倍体细胞系中miR-503-5p的表达水平进行qRT-PCR检测，结果显示，miR-503-5p在LC细胞中低表达，这说明在LC中，miR-503-5p为一个抑癌因子，这与miR-503-5p在其他癌症中的研究[16-22]结果正好相似。本研究通过敲除MALAT1并结合miR-503-5p inhibitor对LC细胞进行转染，进一步对MALAT1和miR-503-5p的靶向关系进行分析，利用qRT-PCR、双荧光素酶活性报告、CCK8、Western blot和Transwell方法对LC细胞的增殖和侵袭进行检测，研究发现，miR-503-5p确实是MALAT1的靶向调节基因之一，且两者为负调控关系，上调miR-503-5p能够抑制LC细胞增殖和侵袭。

一个miRNA可以靶向多个、甚至百个mRNA，其中有30%的mRNA能被miRNA进行调控。FOXK1是正常细胞增殖所必需的Forkhead家族转录因子，也是一种可以调节多种细胞代谢、发育的致癌转录因子[23-24]，属于mRNA。在人类的多种癌症中，FOXK1过表达，并通过与miRNA相互作用而发挥致癌作用。本研究通过生物信息学软件对miR-503-5p和FOXK1的靶向关系进行了预测，发现FOXK1是miR-503-5p的靶向调节基因之一。已有研究[25-28]显示，FOXK1在乳腺癌、前列腺癌、肺鳞癌、胃癌、肝癌中高表达，对癌细胞的增殖、迁移和侵袭有一定的调控作用。而在有关LC的研究中，FOXK1尚未被研究和报道。在此基础上，本研究检测了人二倍体细胞系和LC细胞系中FOXK1的表达情况，发现FOXK1在LC细胞中高表达，这说明FOXK1也为LC中的一种致癌因子。针对这个结果，本研究进一步在敲除MALAT1后，对FOXK1的表达水平进行观察，研究发现，敲除MALAT1明显降低FOXK1的表达水平，这说明MALAT1与FOXK1的调节为正相关。继而又通过qRT-PCR、Western blot、Transwell、克隆形成分析检测发现，FOXK1过表达促进LC细胞的增殖和侵袭，且可以逆转MALAT1低表达对LC细胞增殖和侵袭的抑制作用。总之，FOXK1参与了MALAT1对LC细胞增殖和侵袭的调控。

综上所述，本研究发现，LncRNA MALAT1能够通过靶向miR-503-5p上调FOXK1来促进LC细胞的增殖和侵袭，揭示了MALAT1、miR-503-5p和FOXK1在LC中的基因表达、信号通路及其调控机制。这为LC的诊断和治疗以及预后判断提供了一个新的靶点和理论突破。