水生生物中砷的提取和形态分析的研究进展

张金羽,葛 滢,张春华

(1.南京农业大学 资源与环境科学学院 江苏省海洋生物学重点实验室,南京 210095;2.南京农业大学 生命科学实验中心,南京 210095)

砷是一种广泛分布在海洋、淡水和土壤环境中的类金属元素,有以下4种价态:-3、0、＋3和＋5,赋存形态可分为无机砷和有机砷。无机砷主要为亚砷酸盐[As(Ⅲ)]和砷酸盐[As(Ⅴ)];有机砷主要包括一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三甲基砷酸(TMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、砷糖和砷脂等[1-3]。砷的形态制约其毒性大小,与无机砷相比,有机砷如MMA、DMA、AsB等形态的毒性要小得多。水环境中砷的含量较低,主要以As(Ⅴ)存在[4-5]。水体中大量的藻类等初级生产者可将无机砷吸收、转化为有机砷,并通过食物链传递[6-7],从而对水生生态系统产生显著影响。

不同生物对砷有不同的耐受性,导致砷的解毒机制多样。不同解毒机制导致砷与不同细胞组分结合并进行形态转化,根据转化生成物溶解性大体可分为水溶态、脂溶态和残渣态等3种组分[8-9]。不同组分含有多种砷的赋存形态,其提取、测定方法各不相同。为保证水生生物细胞内砷形态稳定且提取完全,文献[3,10-13]采用了不同溶剂进行单一或分级提取,取得了一定的效果,但目前还没有相关研究的总结。因此,本文总结了淡水及海洋生物中不同组分的砷含量、形态及其提取与测定方法,为深入了解水生生物体内砷的富集代谢规律奠定基础。

1 水生生物中的砷形态

目前已报道的水生生物中的砷形态可分为5类:无机砷、甲基砷、砷甜菜碱、砷胆碱、砷糖、砷脂。

1.1 无机砷

无机砷主要以As(Ⅲ,亚砷酸盐)和As(Ⅴ,砷酸盐)的形式存在,是海水和淡水环境中的主要砷形态,通常在生物体中质量分数较低,约占总砷的0.4%～30.7%[9]。而褐藻、羊栖菜则例外,其含有约占总砷50%以上的无机砷[14];泰国淡水鱼[13]和挪威某些地区的蓝贻贝[15]报道了其中无机砷质量分数较高,约占总砷42%以上。

1.2 甲基砷

在亚砷酸盐甲基转移酶(ArsM)的催化下,无机砷可以甲基化为MMA 和DMA[16-17],还可产生三甲基砷(TMAO)、挥发性TMA 及四甲基砷(TETRA)[17-21]等。这些化合物在海产品中质量分数较小(0.1%～3.6%),主要形态是DMA,软体动物可以含有比鱼类或藻类更高比例的DMA(5%～46%)[22-27]。MMA在海洋环境中并不常见,并且通常仅以痕量存在。TMAO 迄今尚未在海藻中发现,但在一些鱼类中以较高质量分数(2%～8%)存在[28]。

1.3 砷甜菜碱和砷胆碱

砷甜菜碱是双离子型四元烷基砷化合物,其结构高度稳定不易被降解。砷甜菜碱是大多数有鳍鱼类和贝类中砷的主要存在形态(70%～98%),也存在于浮游动物和褐藻、绿藻、红藻等[29-32]。水生生物体内也存在砷胆碱,例如从星斑鲨油中水解碱的不稳定组分中检出了磷脂酰砷胆碱[33],但含量要低于砷甜菜碱。

1.4 砷糖

一些生物可以将无机砷甲基化并合成一系列含有核糖的砷化物,统称为砷糖。海藻从海水中吸收、积累砷并主要以砷糖的形式储存,通常质量分数较高,约占总砷的80%以上[34-35]。软体动物[22,25,36-38]和甲壳类动物[39]这些滤食性、食草动物通过摄入藻类或浮游植物而含有较低质量分数的砷糖(0.2%～28%)。目前已报道了20 多种砷糖,但最常见的4种形式是甘油砷糖(-Gly)、磷酸砷糖(-PO4)、磺酸砷糖(-SO3)和硫酸砷糖(-SO4)。

1.5 砷脂

SADOLIN[40]首次报道了海洋生物中存在脂溶性砷(砷脂),其质量分数为3.0～4.5μg·g-1。藻类以及一些无脊椎动物中也存在砷脂[41-44],但仅在近十年中才揭示了这些化合物的结构和多样性。砷脂的形态结构有很多种,包括含砷脂肪酸(AsFA)[45-47]、砷糖磷脂(AsPL)[47-48]、含砷碳氢化合物(AsHC)[48-50]、含砷长链醇[51]等。到目前为止,已经确定了至少70种砷脂。

2 水生生物中砷形态的提取方法

提取效率高且不改变砷化学形态是砷形态提取的关键。提取效率取决于各种参数,包括样品基质、待提取的形态、溶剂类型、提取方法、提取时间和提取温度等[52]。目前常用的方法是单一提取法,以水或甲醇-水混合液为提取剂,这种方法操作简单,对一些结构简单的藻类和贝类来说效率较高[53-55]。然而对于一些以脂溶态砷为主的藻类和鱼类,若只用一种提取剂,其形态提取率较低。例如MURRAY 等[56]采用甲醇-水混合液超声提取法对普通小球藻进行形态提取,其提取率仅有11%～27%;JANKONG 等[13]采用甲醇-水混合液振荡法对淡水鱼类等的形态提取率仅为37%～54%。

连续分级提取是根据砷与不同细胞组分的结合特性,选择不同的提取剂,将样品中不同组分结合的物质依序分离出来的过程。常用的水溶态砷提取剂有水、硝酸溶液,脂溶态砷提取剂有甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM),分级提取通常结合超声或微波辅助法进行[53,57-58]。以念珠藻为例,MIYASHITA等[8]使用水超声法对其进行形态提取,提取率高达93%,但后期只检测出了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等;XUE等[59]则依次使用水、二氯甲烷-甲醇混合液等多种提取剂连续振荡提取,除上述形态外,还检出了一种砷糖和两种脂溶态砷。这说明相较于单一提取法,连续分级提取法的提取效率更高,且能鉴定出更多种类的砷形态。水生生物中不同形态砷的提取方法见表1。

表1 水生生物中不同形态砷的提取方法Tab.1 Extraction methods for arsenic species in aquatic organisms

表1 (续)

2.1 水溶态

水溶态砷指的是储存在细胞内亲水性的砷化物,一般以无机砷为主,也有少量MMA、DMA、AsB、AsC、砷糖等,一般占胞内总砷质量分数的12%～58%,在一些贝类中其质量分数可达90%[24,53]。

王亚等[65]采用水-微波辅助提取法提取带菌盐藻中不同形态的砷,即以水为提取剂,采用超声振荡充分破碎并提取。该方法常见于藻类的形态提取,如绿藻、褐藻等[10,14,54,61]。JIA 等[62]采用水、甲醇与水的混合物、硝酸溶液这3种不同的提取剂提取并检测了4种贝类样品中不同形态的砷。结果显示:采用微波辅助法,以1%硝酸溶液作为提取剂提取效率较高。然而,硝酸溶液易破坏水溶态砷中不稳定形态的砷如砷糖等结构,导致检测出的形态多为简单的无机砷和甲基砷[59]。

2.2 脂溶态

脂溶态砷指细胞内的含砷脂质,包括含砷脂肪酸、含砷碳氢化合物、含砷长链醇、砷糖磷脂等,结构复杂且含量低,提取难度较高;藻类和贝类的砷脂含量较低,通常占总砷的4.2%～46%[3,10],而一些鱼类中砷脂的质量分数较高,可达62.3%[38]。一般选择亲脂性试剂作为提取剂,如甲醇、二氯甲烷等,可提高效率并确保其结构的完整性。

YU 等[66]使用二氯甲烷与甲醇的混合液对褐藻进行脂溶态砷提取,通过反相色谱法分离鉴定出了21种砷脂。GLABONJAT 等[67]对提取方式进行了优化,以CRM 7405-a羊栖菜为试验材料,考察了三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、甲苯、丙酮等提取剂。结果显示:采用二氯甲烷与甲醇以体积比2∶1组成的混合液为提取剂5 mL 连续提取,并过硅胶柱以去除色素的方法,提取效果较优,且回收率较高。

2.3 残渣态

经过水溶态和脂溶态的连续提取后,剩下的是残渣态砷。其含量随先前的连续提取效率而变化,该组分主要是无机砷。检测方法通常是加入定量的硝酸和过氧化氢进行石墨炉或微波消煮,然后进行总量检测[3]。

3 水生生物中砷形态的检测方法

砷形态的检测方法包括不同砷化物的分离方法和检测方法。目前常用的分离方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)等[8,68-69]。GC无法使各种砷化物同时被衍生成低沸点化合物,具有局限性[70]。CE 具有高效、快速、抗干扰强等优点,但进样量少,因而制备能力差,且灵敏度较低[71]。而HPLC 分离砷形态时不需要样品衍生,可根据分析形态的性质选择适当的色谱体系,且速率快、分辨率高、灵敏度高[72]。

常用的检测方法包括:原子光谱法如原子吸收光谱法(AAS)、原子发射光谱法(AES)、原子荧光光谱法(AFS)等,质谱法如电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等[31,55-56]。

对砷的检测来说,AAS和AES灵敏度低、干扰大,而AFS结构简单、分析成本低、灵敏度高,为降低背景干扰常和氢化物发生法(HG)联用,是近几年报道较多的砷检测方法之一。ICP-MS不仅灵敏度高、且能跟踪多元素同位素信号变化等[73],其检出限可低至ng·L-1级别,特别对于生物细胞中痕量、超痕量的复杂有机砷化物来说是最可靠的形态分析方法[74]。

HPLC-ICP-MS联用技术融合了HPLC的高效分离、高灵敏度、高重现性和ICP-MS的低检出限、宽动态线性范围,是目前检测多形态砷化物的常用方法之一[74]。

HPLC-ICP-MS 与电喷雾离子源-串联质谱(ESI-MS/MS)的联用可通过获得的物质的结构信息来鉴定已知、未知的复杂砷化物,已成为砷形态检测领域的主流技术。

水生生物中不同形态砷的检测方法见表2。

表2 水生生物中不同形态砷的检测方法Tab.2 Detection methods for arsenic species in aquatic organisms

表2 (续)

不同组分砷形态的检测方法差异较大。水溶态砷(包括无机砷、甲基砷、砷甜菜碱、砷糖)的检测多采用阴/阳离子交换色谱法[3,11,43],以不同含量的磷酸铵盐、碳酸铵盐、吡啶等无机试剂作为流动相,根据砷不同形态的酸碱性不同,调节流动相的酸度、种类及含量即可实现不同形态的分离及保留时间的调整。如PÉTURSDÓTTIR 等[3]采用HPLC-ICPMS/ESI-MS联用,以20 mmol·L-1碳酸铵溶液为流动相,通过离子交换色谱法对褐藻进行砷形态分析,分离并检测出了DMA 和4种砷糖。脂溶态砷(砷脂等)则多采用反相色谱法[10,45,51],以甲醇、乙腈等有机试剂为流动相来测定。如AMAYO 等[51]使用RP-HPLC-ICP-MS与ESI-MS联用,以含0.1%甲酸的水和甲醇作为流动相,对毛鳞鱼的脂溶态砷含量进行检测,并确定了砷脂的相关结构。

目前仪器的相关参数设置、接口技术、基体干扰及标准参考物质的匮乏等仍是砷形态分析技术需要解决的关键问题。因此,建立更加快速、高效、完整的样品前处理体系,提高联用技术水平,使各形态砷在得到较好分离的基础上满足超痕量分析的要求,是今后砷形态分析研究的发展方向。

4 展望

本文汇总了水生生物中砷的提取和形态分析方法。随着本领域的不断发展,以往存在的问题,如操作复杂、检测范围有限、样品提取过程中砷化物的结构破坏等,已得到显著改善。尽管如此,砷的提取与形态分析技术仍需不断完善,且应根据样品种类和分析目的进行开发。随着本领域相关分析测定技术的进一步优化,未来将有更多新的含砷化合物得到鉴定,这将深入推进砷的生物地球化学循环研究,为揭示砷化合物的生物合成及其在食物网内的传递机制奠定坚实基础。