超高效液相色谱-串联质谱法同时测定黄芩提取物中4种黄酮类成分

(乌兰察布医学高等专科学校,乌兰察布 012000)

黄芩又名山茶根、土金茶根,为唇形科黄芩属多年生草本植物,在我国北方各省均有种植。黄芩提取物为黄芩干燥根经加工制成的淡黄色粉末,具有清热燥湿、泻火解毒、安胎、止血等功效[1-4],临床上用于治疗上呼吸道感染、肺热咳嗽、肝火头痛、目赤肿痛、湿热黄疸、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症[5-6],其具有药理活性的化学成分主要为黄芩素、黄芩苷、褪黑素、5-羟色胺、汉黄芩苷、野黄芩苷等[7-9]。

目前黄芩的评价主要是通过其药理活性化学成分测定或者色谱指纹图谱等进行品种鉴别、产地来源分析,测定方法包括薄层色谱法[10]、液相色谱法[2,9,11-12]和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)[8,13-14],而中国药典(2015年版)中黄芩提取物定量指标成分仅有黄芩苷一项,不能完全反映黄芩提取物的整体质量。对不同来源的黄芩提取物进行有效成分的定性定量鉴别已成为规范黄芩提取物的质量控制并保证其临床用药安全性、有效性的重要途径。

本工作针对7份不同产地的黄芩提取物,采用甲醇超声提取,经ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离,质谱检测器测定,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定黄芩提取物中黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷等4种黄酮类成分的分析方法,旨在为黄芩提取物的质量控制及其药理活性化学成分研究提供测定方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS型超高效液相色谱-串联质谱仪;Milli-Q 型超纯水器;JP-060型超声波清洗机;5415D 型高速冷冻离心机;Syncore Polyvap型多样品平行蒸发仪。

4种黄酮类成分的标准储备溶液:1 000 mg·L-1,称取黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷的标准物质各50.0 mg,分别置于50 mL容量瓶中,用适量甲醇溶解,并用甲醇定容至50.0 mL。

黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷标准物质均为色谱纯;其余试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.8μm),柱温35 ℃;流量0.2 mL·min-1;进样体积10μL。流动相:A 为0.01%(质量分数,下同)氨水,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～4.0 min 时,A 由80%降至20%;4.0～6.0 min时,A 由20%降至5%,保持2.5 min;8.5～12.0 min时,A 由5%升至80%,保持3 min。

2)质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI),负离子模式;离子源温度150 ℃,脱溶剂温度350 ℃;毛细管电压3.5 kV;碰撞气为氩气,流量0.15 mL·min-1;锥孔气为氮气,流量50 L·h-1;脱溶剂气为氮气,流量600 L·h-1;多反应监测(MRM)模式。其余质谱参数见表1,其中,“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

7份不同产地(山东沂蒙山区、甘肃庆阳、内蒙古赤峰、吉林延边、河北承德、山西临汾、陕西渭南)的黄芩提取物,购自某公司。

称取黄芩提取物粉末样品约0.1 g置于50 mL离心管中,加入4 mL水,涡旋30 s,再加入6 mL甲醇,涡旋混匀后超声提取(超声功率300 W,超声频率28 kHz)30 min,以12 000 r·min-1转速离心10 min,收集上清液。残渣加入4 mL水,涡旋30 s,再加入6 mL甲醇,涡旋混匀后超声提取(超声功率300 W,超声频率28 kHz)30 min,以12 000 r·min-1转速离心10 min,合并上清液,用水定容至50.0 mL,过0.22μm 微孔滤膜后按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱行为

按仪器工作条件对4种黄酮类成分的混合标准溶液进行测定,色谱图见图1。

4种黄酮类成分的二级质谱图见图2。

图1 4种黄酮类成分混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram of mixed standard solution of 4 flavonoids

2.2 质谱条件的选择

采用蠕动泵将1.0 mg·L-1的4种黄酮类成分混合标准溶液以1.0μL·min-1流量连续注入ESI中,分别采用正离子模式和负离子模式对其进行一级质谱分析,得到准分子离子峰(母离子),再对各准分子离子峰进行二级质谱分析,得到碎片离子峰(子离子)。结果表明:4种黄酮类成分在正离子模式和负离子模式下均有响应,但在负离子模式下产生的[M-H]-峰质谱信号强度较强,可能是由于这4种黄酮类成分结构中的羟基在负离子模式下易失去H 而形成稳定的[M-H]-峰。采用二级质谱扫描模式对准分子离子[M-H]-峰进行子离子扫描,优化碰撞电压和锥孔电压,确定各化合物的二级质谱图,并使各碎片离子的质谱信号强度达到最高,选取丰度较大的两个碎片离子作为定性离子和定量离子。试验选择的质谱条件见1.2节。

2.3 色谱柱的选择

试验考察了ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱、UPLC BEH C18色谱柱、UPLC HSS C18色谱柱、UPLC HSS C18SB 色谱柱、UPLC BEH HILIC 色谱柱等5种超高效液相色谱柱对黄芩提取物中4种黄酮类成分分离情况的影响。结果表明:当采用ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱时,4 种黄酮类成分完全分离,保留时间(3.16～10.47 min)适中,且各化合物的色谱峰峰形尖锐对称。试验选用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

2.4 流动相的选择

图2 4种黄酮类成分的二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of 4 flavonoids

试验考察了甲醇、乙腈、水、0.01%(体积分数,下同)甲酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.01%氨水、0.1%氨水等组合为不同流动相体系时对黄芩提取物中4种黄酮类成分的色谱分离效果和质谱离子化效率的影响。结果表明:乙腈-水体系作为流动相时,4种黄酮类成分的质谱响应优于甲醇-水体系作为流动相时的质谱响应;当流动相体系的pH 小于7时,在负离子模式下易产生[M＋H]＋峰和[M＋Na]＋峰,其中黄芩素离子化效率和质谱信号强度较高,其他3种化合物的离子化效率和质谱信号强度不高;当流动相体系的pH 大于7时,在负离子模式下易产生[M-H]-峰,尤其是采用0.01%氨水-乙腈体系作为流动相时,经梯度洗脱,4种黄酮类成分得到了良好的色谱分离效果和质谱信号强度,色谱图中基线平稳,峰宽较窄,峰形尖锐对称。试验选择流动相为0.01%氨水-乙腈体系。

2.5 提取溶剂的选择

水分含量较低的样品在进行分析时,通常在样品前处理时加入一定量水,以提高后续的提取效率。试验考察了水的加入量对黄芩提取物中4种黄酮类成分提取效果的影响。结果表明:水加入量不大于4 mL时,4种黄酮类成分的提取率随水加入量的增大而增大;水加入量大于4 mL 时,4种黄酮类成分的提取率呈下降趋势。试验选择水加入量为4 mL。

试验考察了提取溶剂依次为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷时对黄芩提取物中4种黄酮类成分提取效果的影响。结果表明:4种黄酮类成分可溶于甲醇、乙醇、乙腈和丙酮,微溶于异丙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷;4种黄酮类成分的提取率由大到小对应的提取溶剂依次为乙腈(98.4%)、甲醇(97.8%)、乙醇(94.3%)、丙酮(89.8%)、异丙醇(76.4%)、乙酸乙酯(62.3%)、二氯甲烷(57.1%),其中乙腈对4种黄酮类成分的提取率最高,但乙腈提取液中杂质较多,而甲醇对4种黄酮类成分的提取率为96.2%～102%,平均值为97.8%,甲醇提取液中杂质较少。试验选择提取溶剂为甲醇。

2.6 基质效应的评价

为考察黄芩提取物中目标物以外的基质对4种黄酮类成分提取效果的影响,在乙腈和空白黄芩提取物这两种基质中分别加入5.0,100.0,250.0μg·kg-1的4种黄酮类成分混合标准溶液,采用标准加入法评估基质效应(即M＝S2/S1×100%,其中:M为基质效应,S1为乙腈中目标物的质谱响应值,S2为黄芩提取物中目标物的质谱响应值。若90%＜M＜110%,表明不存在基质效应;若M＜90%或M＞110%时,表明存在基质减弱效应或基质增强效应)[15]。基质效应见表2。

由表2可知:M为92.7%～98.7%,即不存在基质效应。

表2 基质效应Tab.2 Matrix effect %

2.7 标准曲线和检出限

分别移取1 000 mg·L-1的4种黄酮类成分标准储备溶液适量,用空白黄芩提取液为基质配制5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的4种黄酮类成分的基质混合标准溶液系列。按仪器工作条件对上述基质混合标准溶液系列进行测定,以4种黄酮类成分的质量浓度为横坐标,对应的质谱响应值为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明:4种黄酮类成分的质量浓度在5.0～500.0μg·L-1内与其对应的质谱响应值呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表3。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表3。

由表3可知:检出限为0.3～1.5μg·kg-1,测定下限为1.0～5.0μg·kg-1。

2.8 精密度和回收试验

按试验方法对空白黄芩提取物样品进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4可知:回收率为91.1%～99.1%,RSD 为2.0%～4.1%。

表3 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.9 样品分析

按试验方法对7份不同产地的黄芩提取物样品进行分析,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples mg·kg-1

由表5可知:不同产地的黄芩中均含有黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷,但其含量存在差异,这与文献[1]、文献[8]报道较为一致;其中黄芩苷含量差异较大,其质量分数为76.3～107.8 mg·kg-1,这种显著性差异可能是由于黄芩品种、生长环境(气温、海拔、降雨量、日照等)、生长年限、贮藏时间及种植技术等差异引起的不同产地黄芩提取物之间相同的化学成分含量不同[16]。因此,利用黄芩提取物中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、野黄芩苷含量不同的特点,本方法可更加全面有效地为黄芩提取物质量控制提供科学数据。

本工作采用UHPLC-MS/MS测定黄芩提取物中黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷的含量。本方法具有灵敏度高、准确度好等特点。