一种快速测定植物油中的草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的方法

诸骏杰，孙文闪，周婷婷，董叶箐，钟寒辉，黄荣博，吴丹虹，徐子健，章 虎

(绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州 310051)

草甘膦(glyphosate，GLY)是一种无选择性除草剂，因为低毒、廉价、高效等特点广泛运用在全世界各个农业和非农业领域，在环境和生物体内不断富集，通过食物和水进入体内，对人体造成危害[1]。草铵膦(glufosinate,GLU)具有低毒、好吸收、高活性、杀草广谱、环境兼容性强等特点,成为世界第二大转基因作物耐受除草剂，通过植物蒸腾作用可以在植物木质部之间进行传导，其速效性在百草枯和草甘膦之间[2-3]。随着草甘膦和草铵膦使用频率不断上升，其残留问题越来越受到公众的关注，我国《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量规定》(GB 2763—2019)规定油脂中草甘膦和草铵膦限量为0.05 mg/kg，其中草铵膦为临时限量。建立简便、准确、可靠、灵敏、快速的植物油中可以同时测定草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid，AMPA)和草铵膦残留的检测方法非常重要。

目前，草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的检测方法有气相色谱法(GC)[4]、离子色谱法(IC)[5-6]液相色谱法(LC)[7]、气相色谱质谱法(GC-MS)[8]、液质联用法(LC-MS-MS)[9-15]等。由于草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸均为强极性化合物，不溶于大部分有机溶剂，难挥发，缺少荧光和发色基团，在常规反相柱上没有保留，难以利用气相色谱和液相色谱进行分离，直接通过紫外、荧光、质谱检测器进行检测，灵敏度太低，因而需要通过衍生反应来改变在气相和液相上的色谱行为以及提高检测器的响应值。前处理繁琐，衍生反应时间长，离子色谱法虽然不需要衍生，但是灵敏度低，杂质干扰严重。

本文中，笔者拟建立一种分散液液萃取非衍生液质联用测定植物油中的草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的方法，样品首先通过正己烷分散，再用乙腈水液液萃取，通过氨基色谱柱进行分离，质谱多反应监测(MRM)测定，外标法定量，以期该法可用于植物油中草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正己烷(色谱纯)，德国CNW科技公司；乙酸铵(质谱纯)，美国赛默飞世尔公司；标准品草甘膦(CAS号：1071-83-6)、氨甲基膦酸(CAS号：1066-51-9)、草铵膦(CAS号：77182-82-2)(纯度>98%)，德国Dr Ehrenstofer公司。

1.2 仪器与设备

LC30A型超高效液相色谱8050型三重四级杆质谱仪(配电喷雾离子源)，日本岛津公司；ACQUITY UPLC-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、ACQUITY UPLC-T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，Waters 公司；DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)，迪马科技；ST16R型高速离心机，美国赛默飞世尔公司；EUFO-945616型涡旋振荡器，TALBOYS公司；Milli-Q型超纯水仪，美国密理博公司；BSA224S型电子天平，德国赛多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取(0.200 0±0.000 5)g食用油(精确到0.000 1 g)于10 mL聚丙烯离心管中，加入0.5 mL正己烷，2 500 r/min涡旋混合20 s，再加入0.8 mL乙腈-水(体积比1∶ 1)，2 500 r/min涡旋混合30 s，10 000 r/min离心2 min，取下层清液过0.22 μm混合膜，待上机测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)、进样量为10 μL、柱温为30 ℃、流速为0.2 mL/min；流动相为A为乙腈，B为乙酸铵-氨水溶液(5 mmol/L乙酸铵溶液，用氨水调节pH到 12)，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱参数

1.3.3 质谱条件

采用ESI源、负离子MRM扫描模式进行质谱条件和离子源参数优化。

1.3.4 标准溶液配制

称取草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸标准品，用纯水溶解配制成200 mg/L标准储备液，4 ℃下保存待用。基质标准曲线的配制：采用空白样品(山茶油、玉米油、大豆油)经分散萃取，用萃取液配制基质标样，草铵膦为0.005～0.1 mg/L，草甘膦、氨甲基膦酸为0.01～0.2 mg/L，现用现配。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 质谱条件的优化

首先采用针泵流动注射连续进样的方式进行质谱全扫描检测，得到被测化合物的一级质谱图，找出每个化合物对应的母离子。然后进行二级质谱扫描，得到相应的子离子。每个化合物找出两对特征离子，分别对碰撞能量和Q1和Q3两个四极杆的偏转电压优化，得到草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸的最佳质谱参数，如表2所示。最后对毛细管电压、雾化气流量、加热气流量、Heat Block温度、DL 管温度、Interface温度进行优化，得到最佳离子源参数：毛细管电压4.0 kV，雾化气流量3.0 L/min，加热气流量10.0 L/min，Heat Block温度400 ℃，DL 管温度250 ℃，Interface温度300 ℃。

表2 草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的质谱条件参数

2.1.2 液相条件的优化

比较ACQUITY UPLC-C18柱、ACQUITY UPLC-T3柱和DikmaPolyamino氨基柱对草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的分离效果，流动相采用乙腈-乙酸铵-氨水溶液，结果如图1所示。由图1可知，C18柱和T3柱上没有保留，峰型不好，有拖尾现象，因此C18柱和T3柱对草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸没有分离作用。氨基柱在糖类等碳水化合物分析广泛应用，于是用它来分析，草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸在DikmaPolyamino氨基柱分离效果好，峰型尖锐对称。

图1 草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同色谱柱上的色谱图

比较乙腈-水、乙腈-乙酸铵溶液、乙腈-乙酸铵-氨水溶液3种流动相体系，结果如图2所示。由图2可知，乙腈-乙酸铵-氨水溶液作为流动相，草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的峰型最好。经过优化得到最佳的液相条件：DikmaPolyamino氨基色谱柱，流动相为pH=12的5 mmol/L乙酸铵-氨水溶液和乙腈梯度洗脱(洗脱程序见表1)。

图2 草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同流动相上的色谱图

2.1.3 前处理条件优化

2.1.3.1 分散剂的选择

理想的分散剂满足两个条件：①对样品具有很好的溶解性，②对萃取剂和目标物不相溶。笔者比较了丙酮、异丙醇和正己烷作为分散剂对植物油提取效果的影响。结果显示，当正己烷作为分散剂时，加入乙腈-水溶液离心后得到明显的分层(结果未显示)。因此，选择正己烷作为分散剂。在保持萃取剂体积相同的情况下，考察分散剂体积分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL对提取效率的影响，结果如表3所示。

表3 分散剂体积对提取效率的影响

由表3可知：目标物的提取率随分散剂体积的增加而升高，0.5 mL以后达到稳定，0.9 mL以后略微下降，于是选择分散剂体积为0.5 mL。

2.1.3.2 萃取剂的选择

当分散剂确定以后，萃取剂对目标物的提取效率起着非常重要的作用，萃取剂既要与目标物有较好的溶解性，又要和分散剂不相溶。笔者将乙腈、甲醇和水按一定比例混合作为萃取剂进行了比较。结果表明，当使用乙腈-水(体积比1∶ 1)混合溶液作为萃取剂的提取效果最好，这可能是由于混合后溶剂极性的改变和流动相相似性共同导致的。因此，最终以乙腈-水(体积比1∶ 1)混合溶液作为萃取剂。当萃取剂为乙腈-水(体积比1∶ 1)混合溶液时，考察萃取剂体积分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL对提取效果的影响，结果如表4所示。由表4可知，随着萃取剂体积的增加，提取效率不断增加，当萃取剂体积增加到0.8 mL以后，提取率无明显提高。考虑到稀释倍数的问题，于是选择萃取剂体积为0.8 mL。

表4 萃取剂体积对提取效率影响

2.1.3.3 萃取时间的选择

萃取时间对目标化合物的提取效率有着不可忽视的影响，在萃取剂和分散剂保持一定的条件下，考察不同的萃取时间(10、20、30、40、50和60 s)对提取率的影响，结果见表5。由表5可知，当萃取时间在30s以后，提取率达到稳定，所以选择30 s作为最佳萃取时间。

表5 萃取时间对提取率的影响

2.2 方法学考察

2.2.1 方法的检出限、定量限、线性范围

通过空白样品不断降低添加草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸标准溶液的浓度来确定检出限(LOD)，当达到3倍信噪比(S/N)时对应的加标浓度分别为0.01、0.02和0.02 mg/kg。通过空白样品不断降低添加标准溶液的浓度来确定定量下限(LOQ)，当达到10倍信噪比(S/N)且回收率大于等于70%时对应的加标量分别为0.02、0.04和0.04 mg/kg。利用玉米油，大豆油和山茶油空白基质配制的草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸标准曲线在0.005～0.1、0.01～0.2、0.01～0.2 mg/L范围内有良好的线性关系，基质标准曲线线性方程和相关系数见表6。

表6 不同基质标准曲线线性方程、相关系数

2.2.2 方法的准确度与精密度

方法的准确度通过空白样品添加回收实验的回收率来考察，精密度通过同一浓度平行添加6次回收率的相对标准偏差(RSD)来获得，分别以玉米油，大豆油和山茶油为对象进行回收试验，加标水平分别为1倍、5倍和10倍定量限，每个水平平行试验6次，结果如表7所示。由表7可知：平均回收率为73.2%～89.6%，精密度RSD值为4.86%～9.24%,符合GB/T27404—2008《实验室质量控制规范基本信息食品理化检测》中的回收率和精密度的要求。

表7 草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的回收率和精密度(n=6)

2.3 实际样品检测

运用上述方法对市场上随机采购的30份食用植物油进行测定，其中花生油7份，大豆油6份，芝麻油3份，玉米油5份，山茶油6份，葵花油3份。草甘膦和草铵膦检出样品分别为3份(2份大豆油和1份山茶油)和1份(山茶油)，含量分别为0.043、0.053、0.106和0.064 mg/kg。与标准方法(GB 23200.108—2018，SN/T 1923—2007)相比，该方法简单、快速准确。

3 结论

建立了分散液液萃取非衍生-超高效液相色谱-串联质谱快速检测植物油脂中草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸的方法，采用正己烷作为分散剂，乙腈-水作为萃取剂，萃取分层后进样氨基色谱柱进行分离，MRM监测，基质外标法定量。该方法前处理简单，有机溶剂消耗量小，样品无需使用酸碱试剂调节pH，无需衍生，快速准确,可用于食用植物油中草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸快速测定，具有一定的推广价值。