采样拭子材质与洗脱方式对表面微生物收集效果的影响

吴岳琴，王 珍，彭醒醒，章 虎，陆 雯

(绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州 310052)

微生物采样涉及各个领域，如食品、餐饮、医疗等方面，而物体表面微生物采样更是其中极重要的一个方面[1-2]。GB 14934—2016食(饮)具消毒卫生标准中规定：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及大肠菌群为餐饮具检测指标。目前的表面微生物采样主要是借助拭子擦拭待检物表面，再转移到培养皿中进行培养。细菌回收率的高低是一个由多因素相互作用的过程，受拭子材质、取样方法、洗脱方式等因素的影响[3]。然而，现有市场上的拭子材质种类繁多，拭子采样转移过程可能会导致较大的微生物计数误差[4]。此外，不同材质的拭子及不同的洗脱方式对物体表面微生物的回收率有较大的影响[5]。拭子材质中常见的有植绒、海绵和棉签等，其中植绒拭子是由尼龙短纤维绒毛头和ABS塑料杆构成的一种一次性采样拭子，在病毒和DNA等采集方面，已有研究发现植绒拭子表现出较好的吸附和释放能力[6-8]，而未见对植绒、海绵和棉签这3种材质的验证比较报道。因此，如何选择性价比高的拭子材质以及合适的洗脱方式来提高表面微生物采样效率成为关键。本文中，笔者以这3种拭子为对象研究评估拭子材质与洗脱方式对表面微生物收集效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium，CMCC(B)50115)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 6538)，南京便诊生物科技有限公司；不锈钢板(规格6 cm×6 cm)、不同材质的拭子(植绒拭子、海绵拭子和棉签拭子)。

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，青岛海博生物公司；0.85%无菌NaCl溶液，自制。

精密移液器，Eppendorf中国有限公司；HFSafe-1200TE型生物安全柜，力康生物医疗科技股份有限公司；LRH-250F型生化培养箱，上海一恒科学仪器公司；WG-2XJ型细菌浊度仪，上海昕瑞仪器仪表有限公司；HTY-302型微生物限度检验仪，杭州泰林生物技术股份有限公司；Lab dancer S25型漩涡振荡器，德国IKA公司；VHX-1000 系列超景深三维显微系统，日本基恩士(KEYENCE)公司；KQ5200E型超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司。

1.2 菌悬液制备

接种大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤中，于36 ℃培养18～24 h，培养物用0.85%无菌NaCl溶液适当稀释，通过测定菌液OD值并结合GB 4789.2—2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定菌落总数测定》方法，制成含菌量分别为1 000、500和100 CFU/mL左右的菌悬液。

1.3 洗脱方法验证

1.3.1 拭子接菌

用精密移液器移取250 μL上述不同含菌量的菌液分别至3种无菌干燥的拭子材质(植绒、海绵和脱脂棉)上，注意滴加时缓慢，并轻轻转动拭子，使菌液均匀分布于拭子上并使其完全吸收，不同浓度的每种菌液分别对应以上3种材质拭子，每组3个平行。

1.3.2 菌液洗脱

将上述染有不同浓度菌的拭子用灭菌剪刀剪去拭子与手接触的部分，将拭子头分别置于装有20 mL无菌生理盐水的试管中，分别采用人工手部振荡100次、涡旋振荡1 min和40 kHz超声清洗1 min，3种不同洗脱方式洗脱后通过孔径为0.45 μm的滤膜过滤，再用20 mL无菌生理盐水润洗大试管，将润洗液继续抽滤，重复4次。用无菌镊子将滤膜取出，平铺在营养琼脂表面，避免滤膜和培养基之间夹留气泡，进行36 ℃、48 h培养并记录菌落数，具体计算见式(1)。

菌数回收率=洗脱的菌落数/制备菌落数×100%

(1)

1.4 模拟采样后洗脱验证

1.4.1 不锈钢板接种

取不锈钢材质的无菌板81块，分为3组，每组27块，吸取100 CFU/mL左右的待测菌悬液1 mL，每种供试菌悬液分别接种在1组不锈钢板上，且接种面积为5 cm×5 cm的正方形，用无菌生理盐水替代菌液接于不锈钢板表面，作为阴性对照，并于层流台下吹干待用。

1.4.2 擦拭取样

1)实验组。取3种材质拭子分别擦拭接有同种供试菌的不锈钢板，每组3个平行。将拭子用0.85%无菌NaCl溶液浸润，分别以30°倾斜角来回均匀涂抹3次[3,9]。用灭菌剪刀剪去拭子与手接触部分，将拭子头置于装有20 mL无菌生理盐水的试管中。

2)对照组。分别吸取100 CFU/mL左右的大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL，分别加入至装有20 mL无菌生理盐水的大试管中，每组2个平行。混匀后，通过孔径为0.45 μm的滤膜过滤，再用20 mL无菌生理盐水润洗大试管，将润洗液继续抽滤，重复4次。用无菌镊子将滤膜取出，平铺在营养琼脂表面，避免滤膜和培养基之间夹留气泡，进行36 ℃、48 h培养并记录菌落数。

1.4.3 指标测定

将获取的装有带菌拭子的试管，分别选择人工振荡、涡旋和超声3种不同洗脱方式洗脱后，通过孔径为0.45 μm的滤膜过滤，再用20 mL无菌生理盐水润洗大试管，将润洗液继续抽滤，重复4次。用无菌镊子将滤膜取出，平铺在营养琼脂表面，避免滤膜和培养基之间夹留气泡，进行36 ℃、48 h培养并记录菌落数。

拭子细菌回收率(DRR)的计算见式(2)。

(2)

1.5 显微镜样品观察

将3种材质的棉签头取下，置于200倍超景深显微镜下观察构造及形态。

1.6 数据处理

采用2016版Excel软件对数据进行处理，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 洗脱方式对细菌回收率的影响

对不同拭子材质在人工振荡、涡旋及超声波这3种不同洗脱条件下收集的菌进行培养后计数，并根据式(1)计算回收率，结果见表1～3。

表1 植绒拭子在不同洗脱方式下的细菌回收情况

表2 海绵拭子在不同洗脱方式下的细菌回收情况

表3 棉签拭子在不同洗脱方式下的细菌回收情况

由表1～3可知，在负荷一定试验菌后的不同材质经不同方式洗脱，3种材质结合3种洗脱方式回收率均达到70%以上，3种洗脱方式均符合验证要求[10]。其中，涡旋振荡和超声洗脱回收率均高于人工振荡洗脱回收率。同时，由表1～3可以发现，植绒拭子取样后，这3种方法来洗脱，洗脱后不同试验细菌的回收率都超过87%，远高于海绵和脱脂棉这2种拭子取样的效果。由此可知，植绒拭子是最佳的采集拭子。

2.2 模拟采样后不同材质拭子洗脱方式对细菌回收率的影响

通过采用大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌人工接种至不锈钢板，分别用不同材质拭子模拟采样过程，结果见表4。

表4 模拟采样后不同拭子材质在不同洗脱方式下的细菌收集情况

由表4可知，3种洗脱方式对供试菌的回收率为50%～85%，对于3种材质的拭子，同一种供试菌进行试验后，不同洗脱方式对细菌回收率的效果从小到大为振荡洗脱、旋涡洗脱、超声洗脱，即通过人工振荡洗脱方式得到的回收率明显低于旋涡洗脱和超声洗脱，超声洗脱方式与旋涡洗脱方式的效果接近。但是人工振荡洗脱虽然简单方便，但是受人的力度及频次影响，很难达到满意的洗脱效果。超声洗脱仪体积较庞大，需要及时更换无菌水，无菌操作较繁琐。而漩涡振荡器体积较小、操作便捷、易清洁，所以是相对优选的洗脱方式。

2.3 拭子材质对细菌回收率的影响

通过对3种材质分别负荷相同菌量，并经过洗脱收集，发现不同拭子材质对细菌的收集能力不同。在同一种洗脱方式下，3种不同拭子材质对回收同一种供试菌能力不相同，其中植绒材质的拭子的回收率明显高于其他2种材质的拭子。通过超景深显微镜200倍镜下观察3种拭子结构，结果见图1。

由图1可以发现：①植绒拭子头结构为整齐的尼龙短纤维束；②海绵拭子头结构为网状结构；③棉签拭子头结构为杂乱的丝状。在这3种材质中，植绒拭子是由尼龙短纤维绒毛头和ABS塑料杆构成的一种一次性采样拭子，尼龙纤维束之间的毛细管作用促进液体样品的强液压吸收，样品保持在表面，使洗脱更容易，海绵拭子由层层网状棉丝构成，样品进入内层网后较难释放，而传统的棉拭子，收集的大部分样品仍然被捕获在头部的纤维基质中，不容易释放或释放量小。本试验结果表明，相较其他2种材质拭子，植绒拭子能达到最大限度的收集能力及释放能力。

图1 3种材质在超景深显微镜200倍镜下的结构

3 结论

综上所述，用植绒拭子采样后经漩涡振荡1 min，可获得最佳的微生物洗脱效果，可作为医疗器具及餐具等表面微生物安全监控的采样技术参考，确保实验准确可靠。