姜黄素对脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为的影响及机制

薄秀梅，贺 玲，张荣丽，杜赛君，徐 洲

抑郁症是以情绪低落、精神萎靡和自主活动减少为临床特征的一类精神疾病。目前传统的抗抑郁药虽有一定疗效，但副作用较大，如导致性功能障碍、降低血压、增加体质量等[1]。因此，从植物中寻找高效、低毒的天然抗抑郁活性成分成为治疗抑郁症的研究热点。动物体内注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可诱发类似抑郁的行为，常作为研究炎症诱导抑郁症的模型[2]。C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路成为抑郁症研究和治疗的新靶标[3]，在神经炎症、氧化应激、大脑缺血等胞外信号刺激下，JNK被激活，作用于下游底物c-Jun等，引起促凋亡蛋白的活化。在抑郁模型动物中，Caspase-3、Bax表达增加，Bcl-2的表达降低，最终通过线粒体凋亡途径诱发细胞凋亡[4-5]。

姜黄素(curcumin，CUR)的分子式为C21H20O6，最早是从姜黄中分离出来的多酚类化合物。研究[6]表明，姜黄素具有抗炎抗氧化等多种功效，可以减少在强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，还可以抑制神经细胞的凋亡发挥神经保护作用[7]。关于姜黄素对脂多糖诱导的小鼠抑郁行为的影响及相应机制未见报道。该研究采用腹腔注射LPS制作小鼠抑郁模型，观察姜黄素对小鼠抑郁行为的改善作用，并进一步探索其是否通过降低JNK磷酸化及抑制神经细胞凋亡发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级雄性健康ICR小鼠30只，体质量15～20 g，由徐州医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证编号：SYXK(苏)2015-0030。实验前适应性饲养1周，饲养环境温度20 ～ 25 ℃，期间自由饮食饮水。

1.1.2主要试剂药品 姜黄素(纯度98%)购自郑州荔诺生物科技有限公司；鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)、JNK、p-JNK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic acid protease-3, Caspase-3)多克隆抗体，兔抗B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；Western blot相关试剂盒购自上海碧云天公司；尼氏染色液购自北京索莱宝科技有限公司；LPS、荧光二抗购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1模型制作和给药方法 腹腔注射LPS(1 mg/kg)制作小鼠抑郁模型。选取30只小鼠随机分为Control组(对照组)、LPS组(模型组)和CUR组，每组10只。CUR组小鼠每日灌胃给予姜黄素40 mg/kg，Control组给予等剂量生理盐水。5周后，LPS组、CUR组小鼠单次腹腔注射LPS、Control组给予等剂量生理盐水，24 h后进行行为学测试及蛋白表达检测。

1.2.2糖水偏好实验 糖水偏好度是评估动物抑郁行为的重要指标之一，参照文献[8]对小鼠进行糖水/纯水消耗实验。小鼠单笼饲养，在LPS或生理盐水注射前，称量好清水瓶与糖水瓶(1%蔗糖溶液)的初始重量，24 h后再次称量，并计算实验前后小鼠清水和糖水消耗量，糖水偏好度计算公式：糖水偏好度(%)=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

1.2.3旷场实验 旷场实验在黑色塑料敞箱中进行，实验时每次将一只小鼠放入敞箱的正中央，应用Anaze Y软件记录10 min内小鼠的运动距离和穿越中心格的次数。

1.2.4强迫游泳实验 将小鼠放入高30 cm，直径11 cm，水深15 cm的圆形透明游泳桶中，桶内水温 (25±1) ℃，每只小鼠预游泳2 min以适应环境。用ZH-QPT系统观察并记录其行为学指标5 min，用Any-maze system软件记录其静止不动的时间。

1.2.5尼氏染色实验 取小鼠大脑PFC区，进行石蜡包埋，经切片(5 μm)、漂片、贴片、烘片后，二甲苯脱蜡，用0.1%尼式染色液在 37 ℃ 环境下染色50 min，染色结束后经洗涤、脱水、透明、封片，显微镜观察神经细胞受损情况，同时每张切片取6个视野计算1 mm2神经细胞存活个数，取平均值。

1.2.6蛋白免疫印迹实验 取小鼠大脑PFC区，根据试剂盒说明书提取总蛋白，取50 μg总蛋白经SDS-PAGE电泳(110 V，200 min)、转膜、封闭、洗膜，加一抗4 ℃过夜，洗膜后，加相应二抗25 ℃避光孵育2 h，洗膜后扫描并拍照，应用软件Image J分析蛋白灰度值，将目的蛋白与非磷酸化蛋白或β-actin灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 姜黄素对抑郁小鼠糖水消耗的影响与Control组(61.30±2.05)相比，LPS组(44.10±3.92)小鼠糖水偏好度降低(P<0.05)；与LPS组相比，CUR组(58.67±1.82)糖水偏好度升高，接近对照水平(P<0.05)。

2.2 姜黄素对抑郁小鼠运动距离和穿格次数的影响LPS组小鼠出现抑郁症状，表现为情绪低落，活动量减少，探索能力下降。而给予姜黄素后上述症状得到改善。统计分析显示，与Control组相比，LPS组小鼠活动总距离缩短，穿越中心格次数减少(P<0.05)；与LPS组相比，CUR组小鼠运动距离明显增加，穿越中心格次数增加(P<0.05)。见表1。

2.3 姜黄素对抑郁小鼠强迫游泳中不动时间的影响与Control组相比，LPS组小鼠不动时间延长(P<0.05)；与LPS组相比，CUR组小鼠不动时间缩短(P<0.05)，见表1。

表1 姜黄素对抑郁模型小鼠行为学的影响

与Control组比较：*P<0.05；与LPS组比较：#P<0.05

2.4 姜黄素对抑郁小鼠PFC区神经元的影响尼式体是神经元的特征性结构之一，广泛存在于神经元的胞体和树突内，与碱性染料结合，显示出蓝紫色，能反映细胞的存活状态。Control组神经细胞胞体形态正常，排列均匀，胞质透明，未见神经元损伤。LPS组大部分细胞分布稀疏，胞核固缩，神经元损伤严重，而CUR组只有少部分细胞损伤。细胞计数结果显示，与Control组比较，LPS组神经元细胞数量减少(P<0.05)。与LPS组比较，CUR组小鼠神经元损伤减轻，细胞数量增加(P<0.05)。见图1。

2.5 姜黄素对抑郁小鼠p-JNK/JNK的影响对Western blot结果进行分析，计算各组p-JNK与JNK比值，并以Control组为基数1.00，计算LPS组和CUR组与Control组的相对比值。与Control组比较，LPS组JNK磷酸化水平升高，p-JNK/JNK增加(3.01)(P<0.05)；与LPS组比较，CUR组JNK磷酸化水平降低，p-JNK/JNK降低(1.86)(P<0.05)。见图2。

2.6 姜黄素对抑郁小鼠凋亡蛋白表达的影响Western blot结果条带分析表明，与Control组相比，LPS组Bcl-2蛋白表达降低而Bax、Caspase-3水平升高(P<0.05);CUR组Bcl-2蛋白表达升高，Bax、Caspase-3水平降低(P<0.05)。见图3。

图1 姜黄素对抑郁小鼠神经细胞损伤的影响 ×200

图2 姜黄素对抑郁小鼠JNK磷酸化水平的影响

3 讨论

动物体内腹腔注射LPS诱导产生抑郁症，属于急性应激抑郁模型，且较低剂量更容易引发炎症反应，在旷场实验及暗场实验中出现自主活动减少等症状[9]，该研究利用单次腹腔注射1.00 mg/kg LPS制作小鼠抑郁模型。结果显示，模型组小鼠表现出临床相似抑郁症状，行为学测试表现为：SPT中糖水偏好度降低；OFT中自主活动减少，运动距离变短，穿格次数减少；FST中静止不动时间延长，快感降低等，表明模型制作成功，上述抑郁症状在姜黄素预防性给药的小鼠中明显得到改善。PFC区是导致心境障碍的大脑区域之一，其功能变化在抑郁症发病过程中扮演重要角色[5]。神经元内尼氏体的密度与神经元损伤程度密切相关，是评价神经元损伤程度的重要指标。该研究对PFC区组织形态学的改变进行了评估，结果表明，模型组小鼠的PFC区神经细胞松散，排列不规则，细胞固缩，尼氏体减少。而提前给予姜黄素治疗CUR组，神经元受损状况得到改善，提示姜黄素可以抑制PFC区神经细胞的损伤，从而保护神经细胞。

图3 姜黄素对抑郁小鼠凋亡蛋白表达的影响

研究[10]表明LPS刺激可提高小鼠PFC区的JNK磷酸化水平，导致细胞凋亡和炎症发生。JNK被激活后，p-JNK升高，同时降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白Bax的水平，并进一步促进线粒体内细胞色素c释放到胞质，与凋亡酶激活因子-1相互作用，通过ATP的协助组成凋亡复合体，此复合体迅速结合并激活Pro-Caspase-9，产生Caspase-9全酶，导致Caspase-3的表达明显升高，启动Caspase级联反应，通过线粒体途径诱发细胞凋亡。本研究结果显示LPS组小鼠p-JNK表达量显著升高，提前灌胃给予姜黄素可降低p-JNK的水平，提示姜黄素的抗抑郁作用可能与抑制JNK的磷酸化有关，由于JNK的激活受到抑制，某些基因表达或者新生蛋白质的合成受阻，相关凋亡途径被中断；进一步研究表明LPS组Bax、Caspase-3表达水平升高，Bcl-2表达降低，而给予姜黄素后可逆转这一现象。这些研究结果提示，抑郁症的发生与JNK磷酸化的程度有关，这一观点与之前的研究结果一致，JNK激活后诱导的神经细胞凋亡可能是抑郁症发病原因之一，而姜黄素正是通过抑制p-JNK、降低促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达，提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，从而阻止神经细胞的凋亡，达到抗抑郁效果。

姜黄是亚洲国家的常用食物，对人体健康有积极的作用，同时作为药物，在印度和中国治疗感染、抑郁症等疾病使用了几个世纪[11]。在大鼠抑郁症模型中，使用姜黄素进行实验性饮食治疗，抑制了抑郁大鼠海马萎缩，提高了神经营养因子的水平，同时降低了Caspase-3的表达使抑郁症得到改善[12-13]。Meta分析表明长期补充姜黄素可能会改善患者的抑郁和焦虑症状，因此有学者建议将姜黄素作为饮食治疗[14- 15]。该研究采用的提前灌胃给予姜黄素属于实验性饮食治疗范畴，接近人们日常使用姜黄的生活习惯，使模型更具说服力。

综上所述，LPS通过激活JNK诱导小鼠产生抑郁行为，姜黄素减轻小鼠的抑郁行为可能与降低JNK磷酸化，抑制细胞凋亡，提高神经细胞的存活有关。本实验部分揭示了姜黄素的抗抑郁作用及机制，为寻找抗抑郁药提供了新的思路和实验基础。