右美托咪定对人肝癌Huh-7细胞增殖和迁移的影响

虞 乐，黄春霞，胡 军，周大臣，张 野

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其转移与复发是造成肝癌患者死亡的主要原因。因此，探究肝癌转移与复发机制具有重要的临床意义[1-2]，大量研究[3]显示围手术期的治疗与处理对癌症远期结局具有重要的影响。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一类高选择性α2肾上腺素受体激动剂，作为一种理想的镇静药物被广泛应用于临床实践中[4]。有报道[5]认为DEX可以有效地减轻围术期刺激所造成的应激与炎症反应，而最新的研究[6]提示DEX可促进腺癌细胞在肺脏、肝脏，肾脏等多个器官生长与转移，关于DEX对肝癌细胞的研究鲜有报道。该研究旨在探讨右美托咪定对人肝癌细胞Huh-7增殖和迁移的影响，并探究其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株人肝癌Huh-7细胞株由安徽医科大学第二附属医院肝胆胰外科馈赠。

1.2 实验动物6只♂BALB/c裸鼠，4～6周龄，体质量为(20±2)g，购于江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCKK(苏)2018-0008。

1.3 试剂和仪器DMEM高糖培养基由Hyclone公司提供(货号：SH30022.01)；南美胎牛血清购自美国Gibco公司(货号：10437-028)；MTT(货号：ST316)、RIPA细胞裂解液(货号：P0013B)、和结晶紫水溶液(货号：C0121)均购自北京碧云天生物技术公司；β-actin(货号：3700)和沉默信息调节因子1(SIRT1)(货号：8469)购于美国CST公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号：ZB-2301)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(货号：ZB-2305)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；右美托咪定购自江苏恒瑞医药股份有限公司(货号：180425BP)。生物安全柜(型号：NU-425-400S)、二氧化碳细胞培养箱(型号：NU-5810E)购于美国NUAIRE公司；荧光倒置显微镜(型号：DeltaVision)购于美国GE公司。

1.4 方法

1.4.1细胞培养 将人肝癌细胞Huh-7细胞培育于含10%南美胎牛血清的高糖培养基中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱。待密度为80%左右时，经0.25%的胰蛋白酶消化，重悬，吹打成单细胞悬液，以1 ∶3传代培养。

1.4.2细胞实验分组与处理 将处于对数生长期Huh-7细胞常规接种于96孔板(3.5×104个/孔,100 μl/孔)或6孔板(3×105个/孔，2 ml/孔)，采取随机数表法将细胞分为6组(n=5)：对照组(CON组)、0.1 nmol/L右美托咪定组(D1组)、1 nmol/L右美托咪定组(D2组)、10 nmol/L右美托咪定组(D3组)、氧糖剥夺/复氧复糖组(OGD/R组)、右美托咪定+氧糖剥夺/复氧复糖组(D+OGD/R组)。CON组正常培养；D1、D2、D3组分别加入终浓度为0.1、1、10 nmol/L的右美托咪定；OGD/R组和D+OGD/R 组氧糖剥夺6 h，复氧复糖24 h制备氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型；D+OGD/R组于复氧复糖前加入终浓度0.1 nmol/L的右美托咪定处理24 h。

1.4.3构建氧糖剥夺—复氧复糖损伤模型 当细胞贴壁后，将OGD/R组和D+OGD/R组完全培养液更换为无糖无血清培养基，于37 ℃、5%CO2及95%N2的密闭小室中缺氧培养6 h，之后换成完全培养基，复氧复糖培养24 h，制备氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型。

1.4.4细胞活力的测定 将Huh-7细胞接种于96孔板内，处理结束后每组取3孔，加入5 g/L MTT溶液10 μl 37 ℃孵育4 h后加入150 μl二甲基亚砜室温震荡10 min，采用Synergy HT型多功能酶标仪于波长570 nm和630 nm处测定OD值，用570 nm处OD值减去630 nm处OD值反映细胞活力。

1.4.5Western blot法检测SIRT1的表达 CON组和D1组(根据MTT实验结果选择)，PBS洗3遍，加入RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白质后，用BCA法进行蛋白质定量，加上样缓冲液煮沸10 min变性，以蛋白质60 μg进行SDS-PAGE电泳。转膜后，用含5%～8%脱脂奶粉的TBST室温慢摇封闭3 h，分别加入β-actin或SIRT1抗体。4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，对应加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(稀释浓度1 ∶10 000)和羊抗鼠抗体(稀释浓度1 ∶10 000)，室温慢摇孵育1 h。洗膜后用ECL化学发光法检测蛋白表达量，以SIRT1条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反映SIRT1的表达水平。

1.4.6Transwell 实验检测细胞迁移能力 DMEM培养基饥饿Huh-7细胞24 h后，重悬细胞悬液至浓度为2×107个/L。下室中加入含30%胎牛血清的DMEM培养基600 μl，上室中加入经过不同药物处理的细胞悬液150 μl，放人孵箱中孵育24 h，每组设2个复孔。PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定60 min，风干加入0.1%结晶紫染色25 min，PBS洗涤3次。用棉签擦净上室里存留的液体，在倒置显微镜下拍照且计数，随机选择4个不同的视野进行统计学分析。

1.4.7 动物分组及处理SPF级BALB/c-nu雄鼠6只，4～6周龄，饲养于恒温恒湿、置于12 h/12 h昼夜交替的环境中，自由摄取水和食物。采用随机数表法分裸鼠为2组(n=3):对照组(CON组)和右美托咪定组(DEX组)。将Huh-7细胞(5×109个/L)皮下种植于裸鼠右侧腋窝下。待瘤体达50 mm3时，DEX组裸鼠连续6 d注射右美托咪定(0.5 mg/kg)[6]，CON组连续6 d注射相应体积生理盐水，每次注射前记录裸鼠的体质量和瘤体的大小。接种肿瘤细胞30 d后处死裸鼠，取出瘤体记录相应的体积。

2 结果

2.1 右美托咪定对肝癌细胞活力的影响MTT比色法检测结果显示，与对照组相比，加药处理24 h后，D1、D2和D3组的细胞活性上升(P<0.05)，且当右美托咪定浓度为0.1 nmol/L时，人肝癌Huh-7的细胞活性最强(P<0.01)。因此选择0.1 nmol/L为本实验的最适浓度。见表1。

表1 右美托咪定对Huh-7细胞活力的影响

2.2 右美托咪定对肝癌迁移能力的影响如图1所示，0.1 nmol/L右美托咪定作用于人肝癌Huh-7细胞24 h后，穿膜的细胞数多于对照组。结果表明，右美托咪定增强了人肝癌Huh-7细胞的体外迁移能力，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 右美托咪定后处理对肝癌细胞缺氧缺糖/复氧损伤的影响如表2所示，与对照组相比，OGD/R组的细胞活力下降(P<0.05)。与OGD/R组相比，0.1 nmol/L的右美托咪定处理24 h可以减轻缺氧缺糖后复氧复糖造成的细胞损伤，提高人肝癌细胞Huh-7的细胞活力(P<0.05)。

2.4 右美托咪定后处理对缺氧缺糖/复氧复糖损伤后肝癌细胞迁移能力的影响如图1所示，与对照组相比，右美托咪定组穿膜的细胞数增多，而OGD/R组穿膜的细胞数相对减少。与OGD/R组相比，D+OGD/R组穿膜的细胞数增加。结果表明，右美托咪定后处理可增强缺氧缺糖/复氧损伤后人肝癌细胞的迁移能力(P<0.05)。

图1 右美托咪定对Huh-7细胞迁移能力的影响

表2 右美托咪定对OGD/R损伤后Huh-7细胞活力的影响

2.5 右美托咪定对Huh-7细胞SIRT1表达的影响Western blot 结果显示，与CON组比较，D1组SIRT1的蛋白表达量增加，而OGD/R损伤后SIRT1表达下降。加入0.1 nmol/L右美托咪定后处理24 h可以减弱OGD/R损伤造成的SIRT1的表达减低。提示右美托咪定可以上调SIRT1表达(P<0.05)，右美托咪定促进人肝癌Huh-7细胞株增殖与迁移可能与SIRT1上调有关。见图2。

图2 右美托咪定对Huh-7细胞SIRT1表达的影响

2.6 右美托咪定对裸鼠肿瘤体积的影响如图3所示，DEX组裸鼠的体质量和肿瘤瘤体的大小较CON组无明显差异。

3 讨论

肝癌是世界第三大恶性肿瘤，近年来在世界范围内的发病率急剧增加。我国作为肝炎大国，每年新发肝癌患者占全球新发总数的50%，发病率位列世界第一[7]。尽管肝癌诊疗水平不断提高，手术切除仍是最主要治疗手段。外科干预可以通过多种途径影响肿瘤的转移和复发，而肿瘤的复发与转移已经成为影响肝癌患者术后远期预后的关键性因素。研究表明围术期麻醉药物，可以直接影响癌细胞增殖和细胞介导的免疫，从而间接干扰肿瘤的复发和转移[8]。

图3 右美托咪定对裸鼠瘤体大小的影响

右美托咪定作为一种常用的麻醉药物，研究显示其对肿瘤患者有双重作用。一方面，它可以治疗肿瘤引起的持续性疼痛、躁动和谵妄，为肿瘤患者提供新的治疗方案[9]。另一方面，有研究[10]指出右美托咪定可以通过改变上皮黏附因子表达，增加毛细血管通透性来影响肿瘤的扩散和转移。探寻右美托咪定对肝癌细胞的生物学行为的影响具有重要意义。在本研究中采用MTT法检测右美托咪定对人肝癌Huh-7细胞的影响，结果表明0.1 nmol/L的右美托咪定处理24 h对人肝癌Huh-7的促增殖效果最明显。并在体外缺氧缺糖模型中证实0.1 nmol/L右美托咪定后处理24 h，可以逆转缺氧缺糖/复氧复糖造成的人肝癌细胞损伤。运用Transwell法检测右美托咪定对人肝癌细胞Huh-7迁移能力的影响，证实右美托咪定可以增强人肝癌Huh-7的迁移能力。Wang et al[11]研究提示右美托咪定增强肿瘤细胞的增殖和转移能力，可能是通过增加Ki67蛋白和细胞周期蛋白D的表达来完成。而陈泳花 等[12]研究表明右美托咪定通过下调HIF-1α的蛋白表达来抑制由缺氧诱导的肝癌MHCC97H和SMCC7721细胞的增殖以及血管生成。这种差异可能是因为缺氧诱导的细胞线粒体损伤程度的不同所造成。

本研究裸鼠实验显示右美托咪定并不能增加裸鼠肿瘤的体积。Wang et al[11]的研究同样证实右美托咪定不能增加A549细胞构建肿瘤大小。这可能是由于在体模型复杂的病理生理状态影响了右美托咪定的药理作用。同时观察时间较短(30 d)与样本量较小(n=3)也造成了实验一定的局限性。

SIRT1是Sir2的哺乳动物同源体，是高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶。SIRT1可以调控细胞增殖、应激反应、维持基因稳定性和肿瘤的发生发展。但是SIRT1在肿瘤中的作用仍存在很大争议[13]。有临床研究[14]证实SIRT1高表达的患者，其肿瘤体积更大并且远期生存率更低。本实验采用Western blot法证实，右美托咪定促进人肝癌细胞Huh-7增殖和迁移的同时上调了SIRT1的表达。

综上，右美托咪定可以增强人肝癌Huh-7细胞增殖和迁移的能力，其分子机制可能与上调SIRT1表达有关。在后期研究中将进一步完善右美托咪定作用于人肝癌细胞的分子机制，为提高患者远期生存率提供新的思路。