定向冷冻明胶支架的原位细菌纤维素培养及支架中的细胞行为

江 雨，吴擢彤，王宝秀，王华平，李 喆

(东华大学材料科学与工程学院，纤维材料改性国家重点实验室，上海 201620)

将生命科学与工程学的原理和方法相结合，设计并开发出人体损伤组织和器官的临床替代物，这就是组织工程[1]。组织工程的概念被正式提出后引起了广泛关注，近些年更是取得了飞速发展，现在已经可以构建多种人体组织，但其进一步发展仍然面临着多种问题，如种子细胞的选取、适宜的体外培养条件等，其中寻找一种合适的支架材料一直是研究人员探索的方向之一[2]。

组织工程支架的设计理念是尽可能模拟人体天然细胞生长的环境。研究表明，天然组织经脱细胞处理得到的细胞外基质(ECM)是由纳米纤维组装而成的微米级多孔网络，这种微/纳结构不仅能支持细胞的迁移、增殖和组织的长入，而且可以促进细胞的粘附与蛋白表达[3-5]。尤其是材料表面的微/纳米定向结构对细胞行为和功能表达都有显著影响。这种具有表面微/纳米定向结构的支架在软骨、心肌、神经组织工程等领域都有着广泛的应用[6-7]。现在已经发展出多种设计制备具有定向结构的组织工程支架的方法，如水凝胶技术、溶剂浇铸技术、静电纺丝法和快速成型技术等，其中操作简单，较为常用的是定向冷冻干燥法[8]。在目前已知的天然纤维中，BC的纳米网络形貌与天然ECM最为接近，此外，BC还具有高持水性、良好的生物相容性和优异的力学性能，在组织工程领域有广泛的应用[9-10]。但由于其结构致密，难以使组织细胞长入。

本文以明胶为原料，采用定向冷冻干燥法制备出定向明胶支架，并通过原位培养技术在支架孔道结构中引入BC纳米纤维网络，构筑出兼具微米多孔和纳米纤维结构的BC基微/纳支架，并对支架的微观结构进行表征，探究这种定向结构对细胞行为的影响。

1 试 验

1.1 原料和试剂

明胶、乙醇、戊二醛均为分析纯，购自国药集团；磷酸盐缓冲溶液、Live/Dead试剂盒，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚均为生化试剂，均购自Life Technologies有限公司；超纯水，自制。

1.2 仪器设备

场发射扫描电镜，HitachiS-4800型，日本日立；激光共聚焦显微镜，TCS SP5Ⅱ型，德国Leica公司；酶标仪，Flexstation3型，美国MD公司。

1.3 定向G/BC支架的制备

在聚四氟乙烯的容器中放入一个直径为10 cm的金属铜块，铜块上放置三个直径为3 cm的聚四氟乙烯套管，套管外层用聚苯乙烯的泡沫包覆，进行隔热处理，搭建成简易的定向冷冻装置。将配制好质量分数为6%的明胶溶液倒入聚四氟乙烯模具中，放入定向冷冻装置中，加入液氮，冷冻4 h，待其冷冻完全后，转移至冷冻干燥机中干燥72 h。将干燥好的支架放入质量浓度为2%的戊二醛溶液中浸泡交联10 min，并用大量超纯水清洗，去除支架内残留的戊二醛，然后将干燥后的明胶模板浸入质量浓度为75%乙醇中，于室温下消毒1 h，再用木醋杆菌培养液浸泡清洗3次。之后，将明胶模板裁剪成圆片状，放入尺寸为10 cm×10 cm的方形培养皿中，取初始菌种的密度为5×105cell/mL的发酵培养液40 mL，缓慢滴加到明胶模板上，使菌液被模板均匀吸收，然后将方形培养皿转移到30 ℃的恒温培养箱中，静置培养一周，得到定向G/BC复合支架。利用非定向冷冻的方式制备的样品作为参照。

1.4 测试与表征

1.4.1 场发射扫描电镜

采用场发射扫描电镜对支架的微观结构和不同复合支架上L929细胞的微观形态进行观察。将冻干支架截取2 mm×2 mm×2 mm的试样进行喷金溅射处理，提高样品表面导电性，然后用FE-SEM观察支架的上、下表面以及截面处的微观形貌。

1.4.2 激光共聚焦

采用钙黄绿素荧光染料(Calcein-AM)标记支架材料上的活细胞(激发波长为494 nm)，用碘化丙啶标即支架材料上的死细胞(激发波长为528 nm)，然后采用激光共聚焦显微镜在相应的激发波长下对支架表面和内部细胞分布进行观察分析。

1.4.3 酶标仪

采用CCK-8法(WST-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)检测L929细胞在不同支架材料上的增殖情况，使用酶标仪测定每个孔在450 nm处的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 原位培养法制备定向G/BC支架

在传统的冷冻干燥法中，不存在温度梯度，各个方向上冰晶的生长都是一致的，干燥后得到的孔洞结构具有各向同性，不利于细胞生长。本工作采用定向冷冻干燥法对冷冻环境进行了改变，形成某特定方向上的温度梯度，使得晶核朝指定方向生长，干燥后得到的孔洞结构具有各向异性。

如图1所示，通过定向冷冻干燥法制备的明胶支架具有均匀的轴向通道和径向多孔结构，当菌液滴加到支架上时，其均匀的轴向通道可以保证菌种和培养基的快速渗透，而径向相互连通的孔结构又可以为细菌提供充足的附着点，使细菌黏附在支架内部。将接种完的支架放入恒温培养箱，其均匀的轴向通道与相互连通的孔结构有利于氧气和营养物质的输送，为木醋杆菌提供良好的生长条件，使木醋杆菌可以持续合成细菌纤维素，最终成功制备出具有定向结构的支架材料。

这种定向结构同样可以为细胞生长提供充足的氧气、营养物质和粘附点，能有效促进细胞的增殖和生长[11-12]。

图1 原位培养法制备定向G/BC支架的示意图

2.2 定向G/BC支架的各项表征及其细胞行为分析

2.2.1 原位培养前后不同明胶支架的显微分析

在扫描电镜下对原位培养前的明胶支架进行观察，结果如图2所示。从图2(a)和(b)中可以看到，非定向明胶支架为均匀多孔结构，孔径大小在 100～300 μm范围内，符合组织工程支架的基本要求。从图2(c)和(d)中可以看到，定向明胶支架的表面为多孔结构，截面为通道结构，呈现出明显的各向异性。这是因为在传统的冷冻干燥法中，不存在温度梯度，各个方向上冰晶的生长都是一致的，干燥后得到的孔洞结构具有各向同性，而定向冷冻干燥法对冷冻环境进行了改变，形成某特定方向上的温度梯度，使得晶核朝指定方向生长，干燥后得到的孔洞结构具有各向异性。

图2 原位培养前不同明胶支架的FE-SEM图(a)和(b)分别为非定向明胶支架的表面和截面；(c)和(d)分别为定向明胶支架的表面和截面，标尺为200 μm

在扫描电镜下对原位培养7天后的G/BC复合支架进行观察，结果如图3所示。从图3(a)和(b)中可以看到，非定向G/BC支架内的BC纳米纤维主要集中分布在孔洞内壁上，这是由于BC上的羟基可以与明胶支架上氨基形成氢键，从而提高BC纳米纤维在明胶支架表面的粘附性，但因为支架的连通性较差，BC长入的深度也较浅[13]。从图3(c)和(d)中可以看到，定向G/BC支架除了表面的孔洞外，截面的片层间也分布有BC纳米纤维，这是因为定向支架具有径向多孔和轴向通道结构，这种各向异性的结构一方面能够给木醋杆菌提供丰富的吸附位点，另一方面还可以为木醋杆菌的生物发酵提供充足的氧气和营养物质运输通道，有利于它的生长、迁移和繁衍，从而促进BC的长入。

图3 原位培养后不同G/BC复合支架的FE-SEM图(a)和(b)分别为非定向G/BC支架的表面和截面；(c)和(d)分别为定向G/BC支架的表面和截面，标尺为100 μm

2.2.2 细胞在不同G/BC复合支架的增殖行为分析

通过CCK-8法来探究L929细胞在不同的复合支架上的增殖行为。如图4所示，L929细胞种植在非定向和定向的G/BC支架上第1、3、5天时的吸光度都是不断变大的，这说明L929细胞在两种复合支架上都可以进行正常的增殖行为。将第1、3、5天时各支架的吸光度值进行比较可以得出，非定向和定向的G/BC支架相比存在显著性差异(p<0.05)。这是由于在定向G/BC支架上BC纳米纤维沿着定向冷冻的垂直通道自上而下贯穿整个支架，可以为L929细胞提供丰富的粘附位点，有利于细胞的生长。另一方面，垂直的通道也有利于氧气和营养物质的输送，因而细胞在定向G/BC支架上增殖情况要明显优于非定向G/BC支架。

图4 L929细胞在不同G/BC复合支架上增殖行为(n=4,p<0.05)

2.2.3 细胞在不同G/BC复合支架的分布及形态分析

为了进一步更加直观的评价BC纳米纤维在支架上分布和支架本身的结构对细胞生长行为的影响，我们采用Live/Dead法分析了L929细胞在非定向(图5a)和定向(图5b)的G/BC支架上培养3天后的细胞活力情况。如图所示，在非定向G/BC支架(图5a)上的活细胞数量较多，能观察到少量死细胞，细胞呈现为形态较好的长条形且细胞分布较为均匀，说明细胞在支架上可以较好地分散生长。在定向G/BC支架(图5b)上的活细胞数量很多，几乎不存在死细胞，而且可以看出，细胞呈现出较为伸展的形态，说明细胞在定向复合支架上具有极高的细胞活力，这主要是因为定向通道结构有利于氧气和营养物质的输送，能有效促进细胞生长。另外，L929细胞在定向G/BC支架上的分布呈现出一维取向，这是由于定向G/BC支架的微观表面结构呈现出片层状，而BC纳米纤维大量分布在这些片层间，可以为细胞生长提供丰富的粘附位点，在经过三天的培养后，大量细胞在片层与片层间生长，呈现出一维取向的细胞分布。

图5 L929细胞在不同G/BC复合支架表面上的分布情况(a)为非定向G/BC支架；(b)为定向G/BC支架，标尺为100 μm

本实验用场发射扫描电镜来观察L929细胞在非定向和定向G/BC支架上的生长形态。L929细胞在非定向G/BC支架(图6a)上呈梭形放射伸展的状态，其大量的伪足向四周扩散且与支架表面的BC纳米纤维紧密粘附形成细胞纳米纤维复合物，这种复合物有利于保持L929细胞在材料上的细胞活力，使细胞以舒展的状态生长。从图6b中可以看到，L929细胞在定向G/BC支架上会沿着支架片层的方向生长，这一方面是由于片层上存在大量BC纳米纤维，纳米纤维与细胞间形成的复合物可以提高细胞在支架上的粘附性，另一方面，定向通道结构也可以为细胞生长提供充足的氧气和营养物质，促进细胞生长，随着时间的延长，细胞与细胞间紧密相连，呈现梭形伸展的细胞生长形态，并形成细胞层。

图6 L929细胞在不同G/BC复合支架上培养5天后的细胞形态(a)为非定向G/BC支架；(b)为定向G/BC支架，标尺为10 μm

3 结 论

本文以明胶为原料，采用定向冷冻干燥法制备出定向明胶支架，通过原位培养技术在支架内引入BC纳米纤维网络，构筑出兼具微米多孔和纳米纤维结构的BC基定向微/纳支架。这种定向支架具有径向多孔和轴向通道结构，呈现各向异性，有利于氧气和营养物质的输送，可以有效促进细胞的增殖与生长，具有良好的生物相容性。