不同地区妊娠期女性叶酸代谢障碍风险及其相关基因多态性的研究

王 玲 梁 雄

围孕期叶酸缺乏可导致妊娠期贫血、妊娠期高血压疾病、死胎、新生儿神经管缺陷、唇腭裂、新生儿先天性心脏病、自闭症等不良妊娠结局的发生[1]。叶酸代谢障碍是导致妊娠期女性体内叶酸缺乏的重要因素之一，其中亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)及甲硫氨酸合酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是叶酸代谢通路中的关键酶，其基因多态性与叶酸代谢障碍息息相关。我国叶酸代谢水平在不同地域女性中分布的差异性缺乏大样本的研究。本研究通过对1415例妊娠期女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 的基因型检测，获取叶酸代谢关键酶基因多态性，分析部分妊娠期女性叶酸代谢基因的分布特征，为进一步的群体遗传分析奠定基础，给予不同地域围孕期女性的叶酸补充提供依据。

对象与方法

1.研究对象：选择2018年1月1日～2019年10月30日在珠海市人民医院产前检查妊娠早期女性为研究对象。研究对象年龄19～45岁，平均年龄30.08±4.59岁，均同意进行口腔黏膜细胞采样并进行叶酸代谢基因遗传检测，根据研究对象籍贯，将其分为南部地区500例(广东省、广西壮族自治区、湖南省)、中部地区465例(安徽省、湖北省、江西省、河南省)、北部地区450例(河北省、山东省、黑龙江省、辽宁省)3组。共获取符合以上条件的有效样本及结果1415例，其中汉族1402例，少数民族13例。

2.样本采集及DNA检测方法：(1)样本采集：使用专用采样拭子采集口腔黏膜上皮脱落细胞。该方法无创、无交叉感染、操作简单方便。(2)检测设备：采用美国Applied Biosystems公司的7900型荧光定量PCR仪，检出率可达99%以上，可重复性达到100%。(3)基因分型技术：采用荧光定量PCR技术，对MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G进行基因分型。每个样品检测孔中加3.5μl去离子水，1μl浓度为20ng/μl的DNA模板，0.5μl的20×Taqman-MGB和5μl的2×Taqman Universal Master Mix探针，探针信息详见表1。PCR反应初始温度为95℃ 10min，92℃ 15s、60℃ 1min扩增20个循环，最后用89℃ 15s、60℃ 90s扩增30个循环。结束后，根据各反应孔的荧光，确定各样本基因分型结果。

表1 Taqman-MGB 探针位置

3.统计学方法：采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，对研究对象进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。组间比较采用行×列表的χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.不同地区育龄女性MTHFR、MTRR的基因多态性比较:统计样本人群中叶酸代谢障碍相关3个位点(MTHFR A1298C、MTHFR C677T、MTRR A66G) 的基因型数据并进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，发现这3个位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，证明研究对象具有该区域群体代表性。MTHFR A1298C 3个基因位点AA(野生型)、AC(杂合突变型)、CC(纯合突变型)在南部、中部、北部3地区基因型分布多态性存在不一致，差异有统计学意义(P<0.05)，其中AA型在南部地区、中部地区和北部地区的比例为58.00%、63.87%和76.89%，呈南低北高趋势。MTHFR C677T 3个基因位点CC(野生型)、CT(杂合突变型)、TT(纯合突变型)在南部地区、中部地区和北部地区多态性分布不一致，差异有统计学意义(P<0.01)。CC型在南部地区、中部地区和北部地区的比例分别为57.80%、35.27%和14.67%，呈南高北低趋势。MTRR A66G AG(杂合突变型)、CG(纯合突变型)在3地区构成比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 3地区育龄女性MTHFR、MTRR的基因位点多态性比较 [n(%)]

2.不同地区育龄女性MTHFR、MTRR的等位基因频率比较：MTHFR A1298C等位基因A和C频率变异比较3地区存在明显差异，差异有统计学意义(P<0.01)，其中突变C基因频率南部地区比北部地区高11.23%；MTHFR C677T基因位点C和T在3地区频率比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中MTHFR667基因T基因频率南部地区(24.20%)明显低于北部地区(60.67%)；MTRR A66G基因位点中，A、C、G基因频率南部与其他两地区比较差异有统计学意义(P<0.05)，但中部地区及北部地区3个等位基因分布比较差异无统计学意义(P>0.05)，其中C基因频率南部地区明显高于其他两地区，G基因频率南部地区明显低于其他两地区，详见表3。

表3 3地区育龄女性MTHFR、MTRR的等位基因频率比较[n(%)]

3.不同地区育龄女性叶酸代谢障碍风险分析：根据本研究结果，南部地区、中部地区和北部地区叶酸代谢高风险的人群比例分别为11.80%、25.16%和38.23%，差异有统计学意义(P<0.01)；南部地区、中部地区和北部地区中风险的比例分别为37.80%、31.40%和25.33%，差异有统计学意义(P<0.01)；南部地区、中部地区和北部地区叶酸代谢低风险的人群比例分别为6.40%、10.54%和9.33%，差异无统计学意义(P>0.05)；南部地区、中部地区和北部地区叶酸代谢无风险的人群比例分为44.00%、32.90%和27.11%，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表4。

表4 3地区育龄女性叶酸代谢障碍风险分度结果[n(%)]

讨 论

妊娠期女性体内的叶酸水平低于非妊娠期女性，并随孕周增加而逐渐下降，故孕期是急需补充叶酸的特殊时期[2]。妊娠期的叶酸缺乏可导致妊娠期并发症的发生、胎儿畸形甚至影响子代健康等不良后果[3]。既往研究表明,MTHFR、MTRR均是叶酸代谢过程中的关键酶，MTHFR在 5,10-亚甲基四氢叶酸还原成为5-甲基四氢叶酸的过程中起催化作用，后者在MTRR催化下参与人体内广泛的甲基化反应，如同型半胱氨酸甲基化为甲硫氨酸，复甲基化为S-腺苷甲硫氨酸等。MTHFR、MTRR基因不同位点的突变会降低其酶的活性，不同程度的降低孕妇叶酸代谢水平[4]。所以了解不同地区妊娠期女性叶酸代谢基因位点及其变异特征，对基层医院指导孕妇补充叶酸显得非常重要。

C677T是MTHFR基因最常见的位点变异。MTHFR第667位核苷酸上胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，使编码的氨基酸序列改变，缬氨酸替代丙氨酸，导致MTHFR酶的耐热性和活性下降，使5,10-亚甲基四氢叶酸还原成为5-甲基四氢叶酸减少，从而降低体内叶酸水平[5]。研究显示，母亲MTHFR C677T纯合子突变使出生神经管缺陷婴儿的风险升高,携带677T等位基因的孕妇比野生型孕妇生育唐氏综合征患儿的风险大, 胎儿患先天性心脏病的概率较CC型高[6～10]。通过对MTHFR、MTRR的3个基因多态性比较，南部地区、中部地区及北部地区存在地域差异，北部地区和中部地区MTHFR C667T的基因TT型率分别为36.00%和21.07%，明显高于南部地区(5.80%)，同时叶酸代谢障碍高风险人群北部地区比南部地区高26.43%，提示此基因位点突变可能是导致叶酸代谢障碍的危险因素，此结果与贺宪民等[11]的研究结论一致。

A1298C位点突变是MTHFR基因另一个主要的位点变异。其突变导致编码的氨基酸序列中谷氨酸被丙氨酸替代，导致MTHFR酶的活性下降，但耐热性不变[5]。本研究结果显示，A1298C基因AC型、CC型在3地区存在差异性，南部地区AC型、CC型高于中部地区和北部地区，但北部地区孕妇叶酸代谢障碍的发生率却明显高于南部地区。既往也有研究指出，A1298C基因AC型、CC型广东及海南地区高于河北地区，且部分研究发现母亲的MTHFR A1298C基因位点突变与不良妊娠结局、新生儿神经管畸形、新生儿先天性心脏病的发生无明显相关性，提示单一的MTHFR A1298C基因突变是否会导致人群叶酸代谢障碍需进一步研究[12～15]。A66G是MTRR基因最常见的变异位点，在本研究中，MTRR A66G基因的突变型AC型、CG型在3地区比较差异无统计学意义。

个体对于叶酸的利用能力，是由叶酸代谢酶的基因多态性决定的。在服用同剂量及同疗程叶酸的情况下，叶酸代谢障碍人群血清和红细胞中的叶酸水平低于正常人群[16]。本研究结果显示，叶酸代谢高风险人群在北部地区的比例为38.23%，比南部地区高26.43%，比中部地区高13.07%；未发现风险组北部地区低于南部地区16.89%。孔亚敏等[17]通过分析2004～2011年中国神经管缺陷(NTDs)报告得出我国NTDs发生率呈现北高南低的规律，与本研究结果一致。

综上所述，叶酸基因代谢风险存在地域差异，尤其是北部地区，近一半的妊娠期女性存在叶酸代谢高风险，此结果对于尚未开展叶酸代谢检测的基层地区的围孕期女性孕期是否需要继续或者加量服用叶酸提供指导。若本研究扩大样本量，进行南部地区、中部地区和北部地区多中心研究，则研究结果更有说服力。