苯丁酸钠通过下调CLDN4基因DNA甲基化对喉鳞状细胞癌增殖与凋亡的作用研究

卡衣赛尔·卡哈尔 艾力根·阿不都热依木 谭元元

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是一种侵袭性恶性肿瘤，为喉癌最常见的病理类型，吸烟、饮酒、空气污染和不健康饮食等均是LSCC 发生的决定因素[1～3]。目前，LSCC的治疗方式主要包括放疗、手术并辅以化疗，这些手段能够使大部分患者的病情得到有效控制，但仍有一些患者病情难以控制，例如术后存在组织与器官损伤、复发或转移以及局部及全身并发症等问题[4，5]。目前，LSCC 的发病机制尚不清楚，因此，了解LSCC进展中的分子调节机制将有助于提高LSCC的诊断和治疗水平。苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate，SPB)是一种诱导分化剂，对多种肿瘤具有诱导分化、凋亡和杀伤作用，可通过抑制组蛋白脱乙酰基酶来抑制肿瘤细胞的生长，调控多种特定基因的转录水平[6,7]。DNA甲基化可以使DNA构象、DNA稳定性、染色质结构以及 DNA 与蛋白质相互作用的方式均发生改变[8]。越来越多的证据表明，DNA甲基化参与了多种疾病的发生和发展，比如在肿瘤中通过调节DNA 损伤、细胞凋亡及细胞黏附等相关基因来发挥作用[9～11]。但苯丁酸钠对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的生物学行为是否有影响，且能否通过 DNA去甲基化发挥作用，目前尚未有文献报道。因此，本研究通过探究苯丁酸钠对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，并从表观遗传学角度探索相关分子机制，为临床LSCC的诊治提供实验依据。

材料与方法

1.材料：喉鳞状细胞癌细胞 Hep-2 (中国科学院细胞库)，苯丁酸钠 (德国 Alexis公司)，胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、RPMI1640培养基、胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)，MTT溶液、DMSO(美国 Sigma公司)，Annexin Ⅴ/PI试剂盒(德国 Bendermed公司)，免疫荧光染色试剂盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，ECL发光试剂盒(美国 Gibco公司)，Taq 酶、RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，DNA提取试剂盒、DNA甲基化试剂盒(美国Thermo Fisher 公司)，兔抗CLDN4、鼠抗β-actin、兔抗caspase-3(北京中杉金桥公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(英国 Abcam公司)。

2.细胞培养：喉鳞状细胞癌细胞 Hep-2复苏后，植入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素双抗RPMI1640 培养基中，放在 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，2～3天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。

3.细胞处理与增殖检测：对数生长期Hep-2细胞经 0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至5×104/ml并接种于96孔板，每孔100μl，在 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h后，弃原培养液，加入终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠，以0mmol/L(不加苯丁酸钠)作为对照组，每组设6个复孔。24h后每孔滴加20μl MTT 溶液，继续培养4h，弃去培养液，每孔滴加150μl DMSO，于脱色摇床上振荡10min，使紫蓝色沉淀充分溶解，采用酶标仪测定波长570nm处测吸光度(A)值。

4.细胞周期检测：经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h 后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，并预冷的PBS洗涤2次，加入70%冰乙醇进行固定，固定24h后，弃乙醇，用PBS洗涤2次并重悬细胞，加入含10μg/ml RNase的盐酸缓冲液在37℃下孵育 30min，再加入500μl PI 进行染色，37℃避光孵育30min，进行过300目筛网，通过流式细胞仪进行细胞周期分析。

5.细胞凋亡检测：经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，预冷的PBS洗涤2次，用500μl 1×Binding Buffer重悬各组细胞，加入5μl Annexin Ⅴ-FITC染液与10μl PI染液，室温下避光孵育30min后，立即采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

6.细胞免疫荧光法检测caspase-3的表达：调整Hep-2细胞密度为 2×105/ml，将灭菌盖玻片吸附于6孔板中，接着将细胞接种于6孔板，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h后，加入终浓度为4.0mmol/L的苯丁酸钠，0mmol/L苯丁酸钠设为对照组，继续培养24h后弃培养液，使用PBS将盖玻片洗涤3次，4%多聚甲醛固定15min，加入0.2%Triton X-100渗透5min，与3%BSA、0.2%吐温共孵育60min，然后加入兔抗caspase-3(1∶100)，4℃孵育过夜，次日PBS 冲洗3次，然后加入Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(1∶750)室温孵育30min。使用DAPI 染细胞核10min，爬片晾干后，封片并在显微镜下观察，进行图像采集。

7.qRT-PCR检测DNMT1、DNMT3a mRNA的表达：用 RNAiso Plus试剂提取经不同浓度的苯丁酸钠处理24h的Hep-2细胞总 RNA，紫外分光光度计检测所提取RNA的纯度与浓度。按照反转录试剂盒说明书步骤反转录合成cDNA，根据 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书检测DNMT1、DNMT3a mRNA水平，以GAPDH 为内参，引物由上海生工生物有限公司合成，DNMT1上游引物：5′-ACCATCACATCTCATTTTGC-3′，下游引物：5′-GGTTTGACTTCGGAGTCTCT-3′;DNMT3a上游引物：5′-TGATGAGCGCACAGAGAGC-3′，下游引物：5′-GTGTTCCAGGTACATTGAG-3′;GAPDH上游引物：5′-TGGGCATCAATGGATTTGGCT-3′，下游引物：5′-ACCATGTATTCGGGTCAT-3′。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性20s，62℃退火15s，72℃延伸45s，一共循环40次，实验重复3次。采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

8.Western blot法检测CLDN4 蛋白的表达：收集经不同浓度的苯丁酸钠处理24h的Hep-2细胞，在各组细胞中加入RIPA裂解液，提取总蛋白，Bradford法对提取蛋白进行定量。取20μg蛋白上样进行10% 的SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜3次，加入兔抗CLDN4 (1∶1000)与鼠抗β-actin (1∶1000)为第一抗体，置于4℃下孵育过夜，次日TBST洗膜3次，并加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗 (1∶5000)常温孵育2h，TBST再次洗膜，滴加ECL发光液进行显色，使用凝胶成像系统对其曝光拍照，再用Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

9.甲基化特异性 PCR：(1)按照DNA提取试剂盒说明书步骤进行操作，提取不同浓度苯丁酸钠处理的Hep-2细胞的DNA。将300ng待测样品 DNA用 DDW稀释至终体积45μl，加入5μl Methyl SEQrTMDenaturation缓冲液，37℃孵育15min， 接着加入100μl reconstituted Methyl SEQrTM溶液，50℃避光孵育16h。将Methyl SEQrTM吸附柱放置在回收管内，加入混合液后4000r/min离心15min，弃废液，ddH2O 冲洗2次，再次4000r/min离心15min，弃上层液，加入350μl的 NaOH溶液继续孵育5min，4000r/min离心15min，弃上层液，再次用ddH2O 冲洗，之后离心处理弃上层液，在吸附柱中心滴加50μl TE缓冲液，室温静置 5min，4000r/min离心2min，收集液体。(2)根据CLDN4基因序列信息，利用 Methyl Primer Express v1.0软件设计两对引物，一对为甲基化引物(M)：上游引物:5′-CTACCGATAAAAACCGTCACG-3′，下游引物:5′-GTGTATTTTGCGAACGTTAAGTTC-3′；另一对为非甲基化引物(U)：上游引物:5′-AATATTACTACCAATAAAAACCATCACAC-3′，下游引物:5′-TGTATTTTGTGAATGTTAAGTTTGT-3′。以修饰后DNA为模板，用两对引物分别进行扩增。PCR扩增体系包括：修饰后DNA模板1μl，上、下游引物(10mmol/L)各1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，Taq 酶 0.5μl, ddH2O补至25μl。扩增条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，PCR 产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

结 果

1.苯丁酸钠对 Hep-2细胞增殖的影响：经0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后，MTT检测细胞增殖情况。与对照组(0mmol/L)比较，不同浓度苯丁酸钠对 Hep-2细胞的增殖均有抑制作用，且细胞增殖抑制率随苯丁酸钠浓度增加而升高(P<0.01)，即呈剂量依赖性，详见图1。

2.苯丁酸钠对 Hep-2细胞周期的影响：通过流式细胞仪检测经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h细胞周期的变化，与对照组(0mmol/L)比较，不同浓度苯丁酸钠处理 Hep-2细胞后，G0/G1期细胞比例显著增加，而S期细胞比例显著下降(P<0.01,图2)。

3.苯丁酸钠对 Hep-2细胞凋亡的影响：用流式细胞仪检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h的凋亡百分率。与对照组(0mmol/L)比较，随着苯丁酸钠浓度增大，细胞凋亡率逐渐增高(P<0.01),详见图3。

4.苯丁酸钠对 Hep-2细胞caspase-3 表达的影响：Hep-2细胞用4.0mmol/L的苯丁酸钠处理后，细胞免疫荧光实验检测caspase-3 表达，对照组(0mmol/L)的Hep-2细胞中caspase-3无表达，4.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后，caspase-3在细胞中表达显著增强(图4)。

5.苯丁酸钠对 Hep-2细胞CLDN4蛋白表达的影响：利用 Western blot法检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞 24h后CLDN4蛋白表达情况，对照组(0mmol/L)中CLDN4蛋白几乎不表达，经过苯丁酸钠处理后，CLDN4蛋白开始表达，且CLDN4 表达水平随苯丁酸钠浓度增加而升高，呈剂量依赖性(P<0.01),详见图5。

6.苯丁酸钠对 Hep-2细胞DNMT1、DNMT3a mRNA表达的影响：采用qRT-PCR检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后，细胞甲基转移酶 DNMT1、DNMT3a mRNA的表达。与对照组(0mmol/L)比较，不同浓度苯丁酸钠处理后，细胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA的表达显著下调，且呈剂量依赖性(P<0.01),详见图6。

7.苯丁酸钠对 Hep-2细胞CLDN4基因甲基化的影响：2%琼脂糖凝胶进行电泳，对照组(0mmol/L)Hep-2细胞甲基化和非甲基化都可扩增出特异性亮度条带，说明CLDN4基因均表达。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后，随着苯丁酸钠浓度增加，非甲基化CLDN4的表达增加，并抑制了甲基化CLDN4 的表达，当苯丁酸钠浓度达到4.0mmol/L与8.0mmol/L时，甲基化CLDN4几乎不表达，详见图7。

讨 论

喉头在人体内具有重要的生理功能，如发声、呼吸、粘连、嗅觉和味觉等，LSCC严重影响了喉头的正常功能，约占所有喉头恶性肿瘤的85%～90%，已成为全世界常见的第11大癌症类型[3]。由于大多数LSCC患者在诊断时已处于晚期且致死率较高，因此，探索LSCC的分子机制并寻找新靶点与新药物将会有助于提高LSCC的综合诊治水平。

苯丁酸钠作为一种低分子量脂肪酸，可协助基因翻译后修饰与折叠，能够抑制淋巴瘤、肝癌、胃癌、脑肿瘤等一些恶性肿瘤的进展[7,12]。Paskova等[13]研究发现，苯丁酸钠可以降低前列腺癌细胞LNCap与C4-2的活力，并降低其黏附力。刘奇等[14]通过不同浓度苯丁酸钠作用胃癌细胞株 SGC-7901后发现，细胞生长和分化能力明显受到抑制，G0/G1期明显增加，且呈时间和剂量依赖性。本研究结果显示，苯丁酸钠能抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖，使细胞G0/G1期阻滞，并诱导细胞凋亡，这与苯丁酸钠作用其他肿瘤细胞的结果是一致的。

CLDN4是紧密连接蛋白的重要组成部分，具有抑制肿瘤发生与发展的作用，例如CLDN4 可有效地抑制胰腺癌细胞侵袭和转移[15,16]。然而，CLDNs在肿瘤组织中的表达受多种调节机制的影响，研究表明，肿瘤进程与DNA甲基化密切相关[17]。近年来，DNA甲基化对肿瘤中CLDNs表达的调节作用已成为研究热点。本研究通过甲基化特异性 PCR检测CLDN4基因甲基化水平，结果显示Hep-2细胞中CLDN4基因呈高甲基化状态，经过苯丁酸钠处理后可明显降低Hep-2细胞CLDN4的甲基化程度，促进 CLDN4基因的去甲基化，进而促进 CLDN4蛋白的表达。

此外，DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNMT)催化，其中，DNMT1被认为是一种维持性DNA甲基转移酶，主要维持CpG甲基化，参与胚胎发育、细胞存活等进程[18]。DNMT3a是从头甲基转移酶，通常参与胚胎发育过程中DNA甲基化模式的建立[19]。总之，DNMT1和DNMT3a共同参与并维持DNA甲基化。本研究中经过钠处理Hep-2细胞后，细胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA表达水平被明显下调。这提示苯丁酸钠可能通过抑制DNA甲基转移酶促进 CLDN4基因的去甲基化，进而抑制Hep-2细胞的增殖并诱导其凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用。因此，苯丁酸钠是一种有潜力的去甲基化生物制剂以及LSCC诊治的待选药物，但其详细机制仍需要进一步深入研究。