肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对大黄鱼免疫性能的影响

江胜滔 陈爱萍 阮俊峰

（1.宁德师范学院 福建宁德 352000；2.闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心 福建宁德 352000）

水产养殖中，农业农村部允许使用的芽孢杆菌是一种好氧、芽孢抗逆性很强的一类细菌。芽孢杆菌利用水中的无机氮源和有机氮源作为底物，快速降解水体中动物的代谢废物、残饵料以及动物尸体等有机物质，达到净化水质的目的、降低水产动物疾病的发生率；芽孢杆菌还分泌多种多样的初级代谢、次级代谢产物，产生各种水解酶类等，降解水产配合饲料中的蛋白质、淀粉、粗脂肪、纤维素、半纤维素等物质，有效提高水产动物的消化率。在恶劣环境下，芽孢杆菌能形成芽孢，因此，用其制成的微生态制剂含有高稳定性、强抗逆性、超高耐温型、极具耐酸碱性、耐加工、便于储藏和运输等优点[1]。广泛用于制备微生物添加剂的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌[2]、地衣芽孢杆菌[3]、蜡样芽孢杆菌[4-5]等。

大黄鱼（Pseudosciaena crocea）属硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属[6]，也叫大鲜、黄花鱼、黄瓜鱼等，是暖温性、濒海中下层集群洄游鱼群，曾是我国著名的四大海洋渔业对象之一[7]。我国的北海南部，经东海、黄海和台湾海峡，是大黄鱼的野生资源主要分布区域，是我国极具特色的地域性海洋鱼类；人工养殖主要分布在福建、浙江和广东一带，而福建人工养殖主要聚集在宁德市，是我国海水网箱养殖单一产量最高的鱼类[8]。近年来，水产养殖业发展迅速，造成养殖水体富营养化，同时也使周边的水域环境和自然生态环境受到极大的破坏[9]。在水产养殖的过程中，过度使用抗生素、杀菌剂等药物，在养殖水域里存在大量的药残，各种各样的耐药菌种就会相继产生[10]，另一方面由于水中环境里有益微生物、藻类的数量和种类减少，养殖水体里的有机物降解速度放慢，水体的自净能力也逐渐降低[11]。大黄鱼的饲养就是以高密度集约化的养殖模式，产量高，但副作用日趋明显，严重破坏了水质，因此水体的修复迫在眉睫。在水产养殖中用微生物添加剂将成为水产养殖接下来研究发展的主要方面[12]。本研究是通过大黄鱼免疫性能试验，探求自主分离筛选的大黄鱼肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对大黄鱼免疫指标的影响，为开发大黄鱼天然、安全、预防疾病的饲料添加剂开辟一个新的途径。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 饲料 大黄鱼配合饲料，购自福建天马科技集团宁德销售点。

1.1.2 菌粉 单一菌粉T1：芽孢杆菌LYC-1固体菌粉，活菌数 1×109CFU/g；复合菌粉 T2：芽孢杆菌LYC-1活菌数 5×108CFU/g、乳酸菌活菌数 3×108CFU/g、酵母菌活菌数2×108CFU/g。以上菌粉均由本实验室提供。

1.1.3 试剂 ELISA鱼溶菌酶试剂盒、ELISA鱼免疫球蛋白试剂盒，均购自上海盈公生物技术有限公司；瑞氏染色液（Wright's stain）购自北京索莱宝科技有限公司；金黄色葡萄球菌菌种购自上海一研生物科技有限公司。

1.2 试验鱼的来源、驯化 试验大黄鱼为当年人工养殖的同一批鱼，由宁德三都澳某水产养殖场提供，并进行驯化。试验前，在水循环水泥池 (6 m×4 m×2 m)中暂养14 d，并以配合饲料(天马牌)饱食投喂，使之逐渐适应试验饲料和养殖环境。

1.3 试验过程 驯养结束后，挑选出体型均匀的大黄鱼600尾（150±3.33）g随机分 3组，即对照组 CK（配合饲料组）、试验组T1、试验组 T2，放养于 3个水循环方形水泥池（3.0 m×3.0 m×1.5 m）中，放养密度为200尾/池。T1、T2两种菌粉按0.2%添加量湿拌到配合饲料中，分别投喂试验鱼，以配合饲料投喂的大黄鱼作为对照组。试验期间，水温为25.0～27.3℃，盐度为22～25，溶解氧在7.0 mg/L以上，每天投喂饲料2次 （05:00和17:00），达饱足。投喂100 d后，各组试验大黄鱼随机取出10尾进行称重、采血和解剖。

1.4 样品收集 100 d试验结束后，对试验鱼饥饿24 h，分别从每个鱼池中随机取10尾鱼，用无菌注射器从尾静脉取血（血样不混合），室温沉降2 h，然后4℃沉降4～6 h，分离血清并保存于-70℃冰箱。

1.5 免疫学指标的测定

1.5.1 头肾体指数（HK-BI） 头肾体指数=（头肾重量/体重）×100%，测算方法：先称量鱼体重，然后断尾放血摘取头肾，生理盐水稍加冲洗，吸水纸吸干表面水分，立即称重，根据记录数据按公式计算。

1.5.2 脾脏体指数（SBI） 脾脏体指数=（脾脏重量/体重）×100%，测算方法与头肾体指数相同。

1.5.3 红细胞、白细胞数 红细胞（Erythrocyte；Red blood cell，RBC）计数：将少量抗凝血用红细胞稀释液（0.089%NaCl）稀释 200倍，取 1滴用 Neubarner计数板在显微镜下统计红细胞数目，将结果换算为每毫升血液中所含红细胞总数。

白细胞（White blood cell，WBC）计数：取 20 μL抗凝血加入盛有380 μL白细胞稀释液（98 mL蒸馏水加入冰醋酸2 mL和3滴1%亚甲兰）的试管中，溶解全部红细胞后，取1滴白细胞悬液在Neubarner计数板、显微镜下计数，结果换算为每毫升血液中所含白细胞总数。

1.5.4 白细胞吞噬指数(PI)和吞噬百分比（PP） 白细胞吞噬指数 （PI）=100个多核型白细胞中含菌总数/100，吞噬百分比（PP）=（100 个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100）×100。吞噬菌体为福尔马林灭活金黄色葡萄球菌或白色葡萄球菌[13]，在0.1 mL抗凝血中加入 1.0×108菌液 0.05 mL，充分混匀，25℃恒温水浴孵育60 min，每隔10 min摇动1次。1 000 r/min离心5 min，用吸管吸取白细胞层涂片，每个样品涂3片，快干时滴甲醇固定约8 min，蒸馏水冲洗后用Wright氏染色液染色15 min，自来水冲洗后再蒸馏水冲洗，晾干后用显微镜观察。

1.5.5 免疫球蛋白IgM含量 按鱼免疫球蛋白（IgM）ELISA试剂盒说明书的操作步骤，通过ELISA标准曲线，计算免疫球蛋白IgM的含量。

1.5.6 溶菌酶（LSZ）含量 按鱼溶菌酶（LYS）ELISA试剂盒说明书的操作步骤，通过ELISA标准曲线，计算溶菌酶的含量。

1.6 计算及统计方法 试验数据用 “平均数±标准差”表示，结果采用Excel 2007和SPSS 19.0版统计软件对所得数据进行单因素方差分析，若方差具有齐次性，则进行LSD多重比较，显著性水平设为P＜0.05；若方差没有齐次性，则进行Mood中位数检验法，差异水平设为P＜0.05。

2 结 果

2.1 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对大黄鱼头肾体指数的影响 大黄鱼头肾体指数（%）测定结果表明（见图 1），F＞F0.05，显示两组微生物菌粉对大黄鱼头肾体指数有显著影响。对照组大黄鱼头肾体指数最低，为（0.08±0.01）%，试验组 T1、T2 分别为（0.10±0.01）%、（0.10±0.02）%。 喂食 T1、T2 两种菌粉，与对照组相比，大黄鱼头肾体指数呈上升趋势，T2显著提高头肾体指数（P＜0.05），T1极显著提高头肾体指数（P＜0.01）。

2.2 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对脾脏体指数的影响 大黄鱼脾脏体指数 （%）测定结果表明（见图2），F＜F0.05，显示两组菌粉对大黄鱼脾脏体指数没有显著影响。与对照组（0.09±0.03）%比较，试验组 T1、T2的脾脏体指数分别为 （0.11±0.02）%、（0.11±0.03）%，大黄鱼脾脏体指数都略为上升，但均无显著差异。

2.3 肠源芽孢杆菌及其复合菌对红细胞 （RBC）和白细胞（WBC）数量的影响

2.3.1 对大黄鱼红细胞数量的影响 测定结果显示（见图3），对照组大黄鱼红细胞数量最少，为（8.66±0.47）×105个/mL，试验组 T1、T2 分别是（9.07±0.17）×105个/mL、（9.17±0.24）×105个/mL， 明显高于对照组。虽然饲喂T1、T2两种菌粉对大黄鱼的红细胞数有影响，但根据Levene方差齐性检验显著性结果P为0.006，小于0.05，说明数据不具方差齐次性。采用非参数检验的Mood中位数检验法分析结果表明，T1与CK、T2与 CK，检验 P值都小于0.05，这两组饲料对大黄鱼红细胞数增加的影响有差异；而T1与T2，检验的P值为 0.361，大于0.05，认为这两组饲料对大黄鱼红细胞数增加的影响没有显著差异。

2.3.2 对大黄鱼白细胞数量的影响 测定结果显示（见图4），菌粉T1对大黄鱼白细胞数没有显著影响，菌粉T2对大黄鱼白细胞数有显著影响。对照组大黄鱼白细胞数最小，为（5.56±0.38）×104个/mL，试验组 T1 为（5.87±0.32）×104个/mL，而试验组 T2 的白细胞数为（6.20±0.48）×104个/mL，高于对照组和试验组T1。与对照组相比较，试验组T2对大黄鱼白细胞数有极显著影响，差异极显著（P＜0.01）。

2.4 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对白细胞吞噬指数（PI）和吞噬百分比（PP）的影响

2.4.1 对白细胞吞噬指数(PI)的影响 测定结果表明（见图5），对照组大黄鱼白细胞吞噬指数最小，为（2.37±0.16）%，试验组 T1、T2 分别是（2.88±0.33）%、（3.27±0.14）%，都高于对照组。虽然饲喂两种菌粉都对大黄鱼的白细胞吞噬指数有影响，但根据Levene方差齐性检验显著性结果P为0.002，小于0.05，说明数据不具方差齐次性。采用非参数检验的Mood中位数检验法分析结果表明，CK、T1、T2相互之间，P值都小于0.05，可认为这三种饲料对大黄鱼白细胞吞噬指数增加的影响有差异。

2.4.2 对大黄鱼白细胞吞噬百分比 （PP）的影响测定结果表明（见图 6），F＞F0.05，显示两组菌粉对大黄鱼白细胞吞噬百分比有显著影响。对照组大黄鱼白细胞吞噬百分比最低，为（26.93±1.86）%，试验组 T1、T2 分别为（29.14±1.46）%、（30.57±2.09）%，明显高于对照组。喂食两种菌粉，大黄鱼白细胞吞噬百分比呈上升趋势，与对照组相比，T1显著提高白细胞吞噬百分比（P＜0.05），T2极显著提高白细胞吞噬百分比（P＜0.01）。

2.5 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对免疫球蛋白IgM含量的影响 测定结果表明 （见图7），F＞F0.05，显示两组微生物菌粉对大黄鱼免疫球蛋白IgM含量有显著影响。对照组大黄鱼免疫球蛋白IgM 含量最低，为（1.15±0.23）μg/mL，试验组 T1、T2分别为（1.47±0.25）μg/mL、（1.72±0.32）μg/mL，明显高于对照组。喂食两种菌粉，大黄鱼免疫球蛋白IgM含量呈上升趋势，与对照组相比较，菌粉T1显著提高免疫球蛋白IgM含量（P＜0.05），菌粉T2极显著提高免疫球蛋白IgM含量（P＜0.01）。

2.6 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对溶菌酶（LSZ）含量的影响 测定结果表明 （见图8），F＞F0.05，显示两组微生物菌粉对大黄鱼溶菌酶（LSZ）含量有显著影响。对照组大黄鱼溶菌酶含量最低，为（1.62±0.20）μg/L， 试验组 T1、T2 分别为 （2.24±0.31）μg/L、（2.35±0.44）μg/L，明显高于对照组。 与对照组相比较，两组菌粉对大黄鱼溶菌酶含量都有极显著影响（P＜0.01）。

从表1可见，对大黄鱼头肾体指数而言，对照组与菌粉T2之间存在显著性差异，与菌粉T1之间存在极显著性差异，但菌粉T1、T2之间没有显著性差异；与对照组相比较，菌粉T1、T2对大黄鱼脾脏体指数的影响没有显著差异；对大黄鱼白细胞数量而言，菌粉T2与对照组之间有极显著性差异，菌粉T1与对照组之间没有显著性差异，菌粉T1与T2之间没有显著性差异；对大黄鱼白细胞吞噬百分比而言，对照组与菌粉T1、T2之间存在显著性差异，T1与CK之间存在显著性差异，T2与CK之间存在极显著性差异，但T1与T2之间没有显著性差异；对大黄鱼免疫球蛋白含量而言，对照组与两种菌粉组之间存在显著性差异，T1与CK之间存在显著性差异，T2与CK之间存在极显著性差异，T1、T2之间也存在显著性差异；对大黄鱼溶菌酶含量而言，对照组与两种菌粉组之间存在极显著性差异，但两种菌粉组之间没有显著性差异。

3 讨 论

3.1 肠源芽孢杆菌LYC-1的作用 微生物添加剂具有着无毒、无害、促进生长的优点，而且可以改良生态环境，降低抗生素的滥用，避免微生物添加剂在水产品中的沉积[14]。在动物饲料的应用上，主要功能是维持生物肠道内的生态平衡[15]、减缓不良反应[16]、调节生物生存环境[17]、提高动物肉品质[18]和取代抗生素的滥用。微生物添加剂是优良的免疫活性剂，对干扰素和巨噬细胞活性的增强具有积极作用，通过其产生的非特异性免疫调节因子等物质激发动物体内免疫，增强动物机体免疫力，特别是对甲壳类动物影响尤为显著[19]。有益菌主要是通过增强动物体内的免疫球蛋白的浓度及巨噬细胞的活性，提高动物机体免疫性能，减少疾病的发生率。

本试验的菌株是从大黄鱼的小肠中段分离筛选得到的，更有益于大黄鱼对该种微生物的定植，激发宿主细胞形成抗体，从而激活免疫系统，提升大黄鱼体内免疫和细胞免疫性能，增强机体免疫力，达到最大的益生效果。但是，T1和CK相比较，对脾脏体指数影响不显著，分析其原因，肠源芽孢杆菌LYC-1对脾脏的增长没有很大的影响，该菌株是从大黄鱼的肠道中获取，对脾脏的刺激比较弱，其增殖速度没有明显的增加，从而影响了脾脏和其他免疫器官协同作用，激活机体免疫应答活动。但试验组T1、T2的红细胞数量比对照组CK多，分析其原因，可能是与鱼的运动程度有关，在养殖过程，观察到试验组大黄鱼的游动速度明显比对照组快，需要的氧要多。

3.2 肠源芽孢杆菌LYC-1复合菌的作用 肠源芽孢杆菌LYC-1复合菌含有一定数量的乳酸菌和酵母菌。乳酸菌在营养充足的条件下有去除硝基氮和亚硝基氮盐的能力，促使氨氮含量增加，对CODMn反应不显著，因此，有学者建议把乳酸菌与光合细菌、芽孢杆菌等菌种混合使用对水产动物生存环境进行综合处理[20]。酵母菌是一种兼性厌氧型的单细胞真核微生物，体内含有必需氨基酸、必需脂肪酸、B族维生素和核苷酸等，具有增强水产动物机体免疫力；酵母菌也能够净化水质，在水产养殖中，一般夏季的水温在20℃左右，而且要不断增氧，给酵母菌提供了比较适宜的生长环境，促进酵母大量生长繁殖，破坏了有害微生物菌群的生态平衡，从而抑制了有害微生物的生长繁殖。

表1 肠源芽孢杆菌LYC-1及其复合菌对大黄鱼免疫性能的影响

笔者通过观察发现T2在水质净化方面明显比T1和CK强；试验过程中，大黄鱼突发了白点病，T1、T2组大黄鱼的死亡率明显比CK组低，经过治疗后，T1、T2组的大黄鱼恢复快，生长速度受影响较小，对没有添加菌粉对照组的影响则相对较大，间接说明了两种菌粉都能提高大黄鱼的免疫性能。从试验结果总体效果来看，与未加菌粉的对照组相比，菌粉T2、T1对提高大黄鱼的免疫性能影响较大，有显著差异；菌粉T2对大黄鱼免疫性能的影响比菌粉T1大，原因是肠源芽孢杆菌LYC-1复合菌粉中的芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌在大黄鱼的肠道内增殖，具有协同效应，它们相互促进、相互依存，共同调节肠道微生态环境的良好动态平衡。