几种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清制备方法的比较

王玉玲 赖道华 潘晶晶 詹先强 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种接触性传染病，各日龄猪均可发病，1987年由美国首先报道。该病以妊娠母猪流产、死产、产木乃伊胎和仔猪呼吸道症状为主要特征，传染性强，危害性大，还可继发感染其他疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。目前，进行疫苗接种是预防、控制猪繁殖与呼吸综合征最主要的措施之一。

根据《中国兽药典》三部（二〇一〇年版）规定，猪繁殖与呼吸综合征活疫苗或毒种必须进行外源病毒检验，该项检验需用抗PRRSV特异性血清对样品进行中和。因此，抗血清的中和效价和特异性对检验起着至关重要的作用。由于市场上能够满足兽用生物制品生产企业检验需求的猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清较少或抗体效价较低，难以满足检验需要。目前，制备方法较多，报道各不一致，我们做了以下几种比较试验，以期找到一种简便易行且免疫效价高的理想方法。

1 材料与方法

1.1 免疫抗原 猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（CH-1R 株，效价为 106.0TCID50/头份），由福州大北农生物技术有限公司现为兆丰华生物科技（福州）有限公司生产；猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗（CH-1R株，灭活前病毒含量为106.5TCID50/0.1 mL），由实验室自制。

1.2 试验动物 动物为2 kg左右的成年健康雄性家兔。

1.3 佐剂 Freund完全佐剂及Freund不完全佐剂，均购自Invitrogen公司。

1.4 动物分组 根据免疫方法的不同分为如下几组：四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫组5只；皮下、肌肉免疫组1免疫5只；皮下、肌肉免疫组2免疫5只；静脉、肌肉免疫组5只。

1.5 免疫方法

1.5.1 四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫（A组）

1.5.1.1 基础免疫 用制备好的抗原-Freund完全佐剂2 mL于家兔四足掌各注射0.2 mL，两后大腿肌肉各注射0.3 mL，颈部皮下2点各注射0.3 mL，共计2 mL。

1.5.1.2 加强免疫 于基础免疫4周后，每只家兔后大腿肌肉各注射0.5 mL不含佐剂的抗原。

1.5.2 皮下、肌肉免疫组1（B组）

1.5.2.1 基础免疫1 取2 mL制备好的抗原-Freund完全佐剂于家兔背部皮下注射8个点，每点0.2 mL，共计 1.6 mL。

1.5.2.2 基础免疫2 首次免疫2周后取制备好的抗原-freund不完全佐剂于家兔背部皮下注射8个点，每点0.3 mL；两侧腹股沟皮下各注射0.4 mL，两侧后大腿肌肉各注射0.6 mL，共计4.4 mL。

1.5.2.3 加强免疫1 间隔1周后每兔两侧腹股沟皮下各注射0.5 mL抗原。

1.5.2.4 加强免疫2 间隔1周后每兔两侧腹股沟皮下各注射0.5 mL抗原。

1.5.3 皮下、肌肉免疫2（C组）

1.5.3.1 基础免疫1 取2 mL制备好的抗原-Freund完全佐剂于家兔颈部皮下注射2点，每点0.5 mL；两侧后大腿肌肉各注射0.5 mL。

1.5.3.2 基础免疫2 首次免疫2周后取制备好的抗原-Freund不完全佐剂于家兔颈部皮下注射2点，每点1 mL；两侧后大腿肌肉各注射1 mL。

1.5.3.3 加强免疫1 间隔2周后取制备好的抗原-Freund不完全佐剂于家兔颈部皮下注射4点，每点0.5 mL；两侧后大腿肌肉各注射2 mL。

1.5.4 静脉、肌肉免疫（D组）

1.5.4.1 基础免疫1 取2 mL制备好的抗原-Freund完全佐剂于家兔静脉注射2点，每点0.5 mL；两侧后大腿肌肉各注射0.5 mL。

1.5.4.2 基础免疫2 首次免疫2周后取制备好的抗原-Freund不完全佐剂于家兔静脉注射2点，每点1 mL；两侧后大腿肌肉各注射1 mL。

1.5.4.3 加强免疫1 间隔3周后取制备好的抗原-Freund不完全佐剂于家兔静脉注射2点，每点2 mL；两侧后大腿肌肉各注射2 mL。

1.6 效价测定 首免后5周开始，每隔1周采集家兔心脏血一次，分离血清后进行抗体效价测定（ELISA法），取测定结果效价较高组别、周别的血清进行细胞中和法测定抗体效价。

2 结果与分析

共免疫家兔20只，D组大兔发生死亡，其他组别无生病死亡。

2.1 ELISA法测定抗体效价 结果见表1。

表1 ELISA法测定中和抗体效价结果

2.2 细胞中和法测定抗体效价 结果见表2。

免疫血清的质量直接影响检验结果的特异性和准确性，制备高效价的免疫血清不仅与抗原的自身性质有关，同时与抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、间隔时间、佐剂应用等因素有关。试验选择了四种不同的免疫方法分别在同一批随机分组的家兔中进行免疫，结果各不相同。除静脉免疫组外，其他几种方法均在首免后6～7周出现抗体效价高峰值，但效价水平有所区别。

四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫（A组）抗体效价大多可达1:20及其以上，最高达1:45。该方法简单、操作简便、整个方案简洁明了，并且该方法所用抗原量较小，可以用于纯化的微量抗原，免疫效果较好。

皮下、肌肉免疫（B，C组）因免疫途径、免疫剂量和免疫程序不同，抗体效价情况也存在较大差异。其中C组抗体效价较高，抗体效价稳定在1:25及以上。该方法所需抗原量较大，但免疫途径最简单（皮下和肌肉），可用于需求量较大的免疫血清的制备，如猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清的制备。

表2 细胞中和法测定中和抗体效价结果

静脉、肌肉免疫（D组）因静脉免疫灭活苗造成大兔在一免或二免后死亡，故无法测定抗体效价，也说明静脉免疫方法因油乳剂的存在，造成机体较大损伤甚至死亡，故在进行油乳剂疫苗免疫时应避免使用该方法。

三种不同的血清制备方法因抗原、免疫途径、免疫程序等不同，抗体效价也存在差异。因此，通过本试验对比发现，四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫可以用于纯化的微量抗原，皮下、肌肉免疫可用于需求量较大的免疫血清的制备，静脉、肌肉免疫不适用于油乳剂疫苗的免疫。