三株鸭源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

郑小兰 程龙飞 黄 瑜

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

禽霍乱是一种由多杀性巴氏杆菌引起的侵害各种家禽和野禽的接触性传染病[1]，临床上可表现为急性型和慢性型。急性型以高热和呼吸困难为特征，多发生于成年禽或产蛋禽，发病急、病程短，往往看见症状后不久即死亡，造成很大的经济损失。慢性型则多表现为局部性感染，如关节炎或肉髯炎等。多杀性巴氏杆菌对多种药物敏感，发病时，饲喂多种药物均能较容易控制该病，但停药后极易复发，反复用药易使多杀性巴氏杆菌获得耐药性，影响复发后的治疗。因此，临床上药物的选择显得尤其重要。本研究近期从福州周边地区分离到3株鸭源多杀性巴氏杆菌，对其血清型和药物敏感性进行测定，为鸭源多杀性巴氏杆菌的血清流行病学调查和近期临床治疗药物的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 福州市晋安区林某饲养的2 000羽产蛋麻鸭，140日龄左右突然发病，死亡13羽。福清市陈某饲养的800羽半番鸭，55日龄时发病，死亡6羽。福州市闽侯县林某饲养的1 000羽番鸭，于76日龄时发病，死亡5羽。3份病料的剖检病变相似，均可见程度不同的心冠脂肪出血；肝脏肿大质脆、可见非常多针尖至针头大小的灰白色小点；肠道肿胀至正常的2～3倍，剪开可见内容物呈胶冻样，有的混有血液。

1.2 试剂及配制 Tryptic soy Agar（美国BD公司产品），取4 g加入100 mL蒸馏水中，121℃高压15 min，自然冷却至60℃左右分装制成TSA平板，保存于4℃冰箱；马丁氏肉汤（海博生物技术有限公司产品），取53.5 g加入1 000 mL蒸馏水中，116℃高压30 min，自然冷却后保存于4℃冰箱；生化鉴定管，广东环凯微生物科技有限公司产品；药敏纸片，北京天坛药物生物科技有限公司产品；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全氏金生物科技有限公司产品。

1.3 细菌的分离及纯化 净化工作台内，取肝组织划线接种于TSA平板，37℃温箱中培养24 h。挑取平板上散在、圆形凸起、边缘整齐、半透明、直径约1 mm的小菌落，再次划线于TSA平板，37℃培养24 h。挑取6～10个菌落接种于马丁氏肉汤，37℃培养18 h。

1.4 细菌的初步鉴定 取少量菌液，进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。取少量菌液，接种生化鉴定管，37℃培养24 h，观察生化鉴定管，按说明书进行结果判定。

1.5 细菌的PCR鉴定

1.5.1 核酸提取及定量 吸取菌液1.5 mL，8 000 g离心5 min，弃上清，按DNA/RNAKit的操作规程提取核酸。取1 μL核酸以NANODROP 2000测定其核酸浓度，调整到100 ng/μL作为模板。3株细菌分别进行。

1.5.2 菌种鉴定和荚膜型鉴定 根据文献[2]合成多杀性巴氏杆菌的种特异性引物、荚膜A型鉴定引物，见表1。两种鉴定分别进行。配制50 μL的PCR反应体系，其中 2×Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 程序： 94℃预变性 5 min；94℃变性 45 s，56℃退火 40 s，72℃延伸60 s，循环30次；72℃ 延伸10 min。取PCR产物4 μL以1%琼脂糖凝胶（含GoldView）电泳，并用凝胶成像系统观察并拍照。将PCR产物送福州博尚生物技术有限公司测序，将序列上传至GenBank进行比对。

1.6 药敏试验 细菌的药物敏感试验采用纸片法。取少量新鲜菌液均匀涂布于TSA平板，待菌液吸收后，将药敏纸片按一定间距摆放在平板上，37℃温箱内培养24 h后观察，量取每个药敏纸片抑菌圈的直径，按中国药检所制定的标准判定细菌对药物的敏感性。

2 结 果

2.1 细菌的初步鉴定 3个病例的肝脏接种TSA平板，培养后均可见大小、形态一致的菌落，菌落凸起于培养基，呈圆形，边缘整齐，大小约1 mm，半透明样。3株细菌分别命名为 FJ2017、FJ2022、FJ2039。革兰氏染色，3株均为阴性短杆菌；瑞氏染色呈两极着染的小杆菌。生化试验结果见表2，3株细菌均可分解葡萄糖、蔗糖和果糖，甲基红试验和VP试验均为阴性，触酶和氧化酶均为阳性，均可产生硫化氢，符合巴氏杆菌的特征。

2.2 细菌的PCR鉴定 3株细菌均可扩增出近500 bp的单一条带，与预期扩增的大小相符。将PCR产物测序，经Blast比对，同源性在99%以上的均为多杀性巴氏杆菌，证实3株细菌均为多杀性巴氏杆菌。细菌的荚膜型PCR鉴定，3株细菌均可扩增出近1 000 bp的单一条带，与预期扩增的大小相符。将PCR产物测序，经Blast比对，同源性在99.5%以上的均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌，证实3株细菌的荚膜型均为A型。见图1。

2.3 细菌的药敏试验结果 3株细菌的药物敏感试验结果见表3。所有菌株都表现出对8种及以上药物的多重耐药性，说明鸭源多杀性巴氏杆菌临床分离菌株具有较强的药物耐受性。3株细菌均耐受的药物有链霉素、四环素、克林霉素和青霉素；均敏感的药物有恩诺沙星、多黏菌素B、复方新诺明和头孢唑啉。

3 讨 论

多杀性巴氏杆菌可侵害多种家禽和家畜，引起猪肺疫，牛、羊、兔等的出血性败血症，禽霍乱等。根据荚膜抗原的不同，可以将多杀性巴氏杆菌划分为A、B、D、E、F共5个荚膜型。除火鸡分离到荚膜F型多杀性巴氏杆菌外[3]，其余禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜型几乎为A型，偶有D型[1]和F型菌株[3]。近两年，陈国权等[4]从贵州的发病肉鸭、程增青等[5]从河南的发病蛋鸭、王红琳等[6]从湖北的发病蛋鸭都分离到多杀性巴氏杆菌，经鉴定，荚膜型均为A型。本研究的结果与他们相同，也是荚膜A型多杀性巴氏杆菌，说明流行于我国的鸭源多杀性巴氏杆菌，其荚膜的血清型没有发生变化，仍是A型占了绝大多数。

表1 引物的序列

表2 3株细菌的生化试验结果

陈国权等[4]从贵州的患病肉鸭中分离的多杀性巴氏杆菌，对多数头孢类、喹诺酮类、氟苯尼考、庆大霉素等敏感，对磺胺类、四环素和多数青霉素类耐药。王红琳等[6]从湖北发病蛋鸭分离的多杀性巴氏杆菌，对诺氟沙星等喹诺酮类、丁胺卡那霉素、新霉素、克林霉素和阿奇霉素敏感，对磺胺类、头孢类、氟苯尼考、链霉素、四环素等耐药。从中可以看出，不同地区流行的鸭源多杀性巴氏杆菌，对药物的敏感性不同。而不同时间流行的鸭源多杀性巴氏杆菌，对药物的敏感性也不相同，比如，同样是福建分离的菌株，刘小龙等[7]2015年分离的3株菌株，均敏感的药物有氟苯尼考和复方新诺明，均耐受的药物有卡那霉素、链霉素、四环素、林可霉素和青霉素。本研究2020年分离的3株菌株，全部敏感的药物有恩诺沙星、多黏菌素B、复方新诺明和头孢唑啉，全部耐受的药物有链霉素、四环素、克林霉素和青霉素。细菌产生耐药的原因是多方面的，主要与养殖过程中长时间、不规范的药物应用有关。本研究结果提示，近期在福州及周边地区的养鸭场，治疗禽霍乱时，优先选用恩诺沙星等喹诺酮类、磺胺类和头孢类药物。治疗过程中不应延长抗菌药物的使用疗程。