2017-2019年宁德市猪瘟及猪伪狂犬病流行病学调查报告

郑教雀 叶裕香吴方达 何 强 张梦迪 陈序传

（福建省宁德市动物疫病预防控制中心 福建宁德 352100）

猪瘟及猪伪狂犬病是制约我国养猪产业健康、稳定发展的两种重要疾病。它们均能引起母猪繁殖障碍、流产、产死胎等问题；同时，还能使猪群免疫力下降、接种疫苗后不易产生有效抗体；此外，它们还能引起多种病原混合感染，使猪的死亡率急剧增加，给猪场带来巨大经济损失。

为了掌握猪瘟及猪伪狂犬病在闽东地区猪群中的感染情况，对2017-2019年收集自宁德市9个屠宰场及随机抽取的48个规模养殖场883份组织样品进行病原检测、5 590份血清样品进行血清学检测。再对检测结果进行分析、讨论，得到两种疫病在闽东地区的流行现状及规律，进而为宁德市制定科学的预防、控制措施及疫病净化奠定基础。

1 材 料

1.1 样品来源

1.1.1 病原学样品 采集对象主要为宁德市9个县（市、区）的定点屠宰场。按置信水平95%、试验的敏感性95%、预定流行率10%计算，每个监测点采样20～30份；同时，根据猪瘟及猪伪狂犬病流行规律，每年选择在3～4月、11～12月监测2次。此外，按照要求选取宁德市9个县（市、区）动物疫控中心所采集的临床发病样品，每季度开展一次病原学检测。

1.1.2 血清学样品 采集对象除了宁德市各县（市、区）的9家定点屠宰场之外，还有48个规模养殖场。这48个规模化养殖场选取原则为，按照预期场间流行率为5%、可接受误差5%，置信度95%，在全市建档的140家规模化养殖场中随机抽取得到。每家规模场采样数量按照估计流行率原则进行抽样，设置置信水平95%、可接受绝对误差10%、预期流行率90%，计算得到每个监测点采集样品35份。与病原学样品一样，也是选择每年在3～4月、11～12月监测2次。

1.1.3 样品采集、运输与保存 采集全血后，应该以最快的速度将所采集的样品送往实验室，再依据试验要求及时进行血清分离。所采集的组织样如果能在24 h内送达实验室，则可以放在4℃左右的容器中运送；如果在24 h内不能将样品送到实验室且不致影响试验检测结果的情况下，可以将样品冷冻并以此状态运送。具体依据 《动物疫病实验室检验采样方法》（NY/T541-2002）对样品进行采集、保存及运输。

1.1.4 问卷调查和登记表 为更好地掌握宁德市规模化养殖场的具体情况，在采样开始之前设计相关调查问卷及登记表，调查问卷内容主要包括规模场所处的地理位置、饲养管理情况、主要疫病免疫背景、近期发生疫病情况等，让采样对象相关工作人员在采样的同时填写调查问卷、登记表。

1.2 主要试剂 CSFV、PRV gB和gE抗体ELISA检测试剂盒均购自IDEXX生物科技有限公司；CSFV荧光RT-PCR检测试剂盒购自上海辉锐生物科技有限公司，PRV荧光PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；其他化学试剂、耗材和药品主要购自生工生物工程 (上海)股份有限公司。

1.3 主要设备 高速台式冷冻离心机、SW-CJ净化工作台、电热恒温培养箱、Tecan infinite F50酶标仪、普朗DNM-9602酶标分析仪、Brand可调微量移液器、QIAGEN TissueLyserⅡ、天隆NP968-C核酸提取仪、Applied Biosystems Step One Real-Time PCR Systems。

2 方 法

2.1 CSFV、PRV gB和gE抗体ELISA检测 按照IDEXX生物科技有限公司试剂盒使用说明书所提供的方法，同时结合《猪瘟诊断技术》（GB/T16551-2008）及《伪狂犬病诊断技术》（GB/T18641-2002.6）进行检测。

2.2 猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒检测

2.2.1 核酸提取 使用天隆NP968-C核酸提取仪自动提取 RNA（DNA），具体方法如下：（1）在 96 孔板的第1、7列各孔中分别加入20 μL蛋白酶K、200 μL样本；阴性、阳性对照参与提取。（2）按表1程序进行自动化提取。（3）自动化程序结束后，第6、12列中的液体即为RNA（DNA）。

2.2.2 猪瘟病毒扩增 使用上海辉锐生物科技有限公司CSFV荧光RT-PCR检测试剂盒进行扩增。从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000 r/min瞬时离心。设所需PCR管数为n（n=样本数＋1管阴性对照＋1管阳性对照），取RTPCR 反应液 15*n μL，Taq 酶 0.25*n μL， 加入至合适的离心管中；再取n/4颗RT-PCR酶颗粒加入离心管，充分混合均匀，2 000 r/min瞬时离心，向每个PCR管中各分装15 μL。

向PCR管中分别加入上述核酸提取步骤中制备的RNA溶液各10 μL，盖紧管盖，瞬时离心。将PCR管放入PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序，设置程序进行以下反应：42℃、30 min；92℃、3 min； 循环 92 ℃、10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃、60 s，共5次；循环 92 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共 40次，每次循环的第二步（60℃、30 s）收集荧光信号（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）；40 ℃、1 s。反应体系设置为 25 μL。

2.2.3 猪伪狂犬病病毒扩增 使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司PRV荧光PCR检测试剂盒进行扩增。设所需PCR管数为n（n=样本数＋1管阴性对照＋1管阳性对照），取无菌无核酸酶水5.9*（n＋1）μL，PCR 反应液 10*（n＋1）μL，荧光探针 2.1*（n＋1）μL，加入至合适的离心管中，向每个PCR管中各分装 18 μL。

向PCR管中分别加入上述核酸提取步骤中制备的DNA溶液各2 μL，盖紧管盖，瞬时离心。将PCR管放入PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序，设置程序进行以下反应：95℃、2 min；循环95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，共 40次，每次循环的第二步（60 ℃、35 s）收集荧光信号（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。 反应体系设置为 20 μL。

表1 猪瘟病毒病原检测自动化提取步骤表

2.3 试验结果判断 阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立。

被检样品Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，判定为阳性；被检样品30＜Ct＜35并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取DNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，则判定为阳性；被检样品Ct值≥35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。

3 流调结果

本调查对2017-2019年在宁德市所收集的样品采用ELISA方法进行抗体检测，采用荧光定量（RT-）PCR方法进行病原检测，结果如下（见表2-表 5）。

2017年检测宁德市9个屠宰场组织样品198份，猪瘟病毒个体阳性率2.5%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率4.0%；9个屠宰场检测血清360份，猪瘟抗体个体合格率91.1%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率80.6%，gE抗体个体阳性率10.6%。检测宁德市48个规模猪场组织样品140份，猪瘟病毒个体阳性率2.9%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率4.3%；48个规模猪场检测血清1 680份，猪瘟抗体个体合格率82.0%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率70.1%，gE抗体个体阳性率17.9%。

2018年检测宁德市9个屠宰场组织样品185份，猪瘟病毒个体阳性率1.6%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率2.7%；9个屠宰场检测血清360份，猪瘟抗体个体合格率90.0%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率83.9%，gE抗体个体阳性率4.2%。检测宁德市46个规模猪场组织样品112份，猪瘟病毒个体阳性率2.7%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率3.6%；46个规模猪场检测血清1 610份，猪瘟抗体个体合格率82.9%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率75.3%，gE抗体个体阳性率12.9%。

2019年检测宁德市8个屠宰场组织样品168份，猪瘟病毒个体阳性率0.6%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率0.6%；8个屠宰场检测血清320份，猪瘟抗体个体合格率88.1%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率87.5%，gE抗体个体阳性率1.6%。检测宁德市36个规模猪场组织样品80份，猪瘟病毒个体阳性率1.3%，猪伪狂犬病病毒个体阳性率2.5%；36个规模猪场检测血清1 260份，猪瘟抗体个体合格率86.0%，猪伪狂犬病gB抗体个体合格率80.5%，gE抗体个体阳性率8.8%。

表2 2017-2019年屠宰场猪瘟、猪伪狂犬病病原学检测统计表

表3 2017-2019年屠宰场猪瘟、猪伪狂犬病血清学检测统计表

表4 2017-2019年规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病病原学检测统计表

表5 2017-2019年规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病血清学检测统计表

4 结果分析

经过对流调结果进行分析可以看到：2017-2019年，不论是屠宰场还是规模场，二者的猪瘟、猪伪狂犬病病原学阳性率都呈现逐年下降的趋势，而且屠宰场的下降幅度较规模场要明显许多，至2019年，屠宰场两种病的病原学阳性率都控制在1%以内。见图1。

血清学检测所得的有效抗体合格率，其趋势则不尽相同。就伪狂犬病gB抗体合格率而言，屠宰场、规模场都呈现逐年升高的趋势，且每年的合格率都在70%以上；伪狂犬病gE抗体阳性率都表现出逐年下降。猪瘟抗体合格率在规模场表现出上升趋势，而屠宰场则呈下降趋势，见图2。

5 讨 论

一方面，2017年国家取消对猪瘟强制免疫；另一方面，2018年8月非洲猪瘟传入我国。考虑到生物安全等因素，大部分猪场工作重心都有所转移，从而忽略了猪瘟、猪伪狂犬病等旧病的危害。

2020年作为国家中长期动物疫病防治规划的收官之年，动物疫病净化工作显得尤为重要。本流调报告通过对全市屠宰场、规模场收集的样品进行检测、统计分析，得到宁德市近些年猪瘟、猪伪狂犬病的流行趋势，为宁德市猪瘟、猪伪狂犬病等疾病的净化奠定了基础，为完成我省的中长期动物疫病防治规划提供有力保障。