HPLC 法同时测定保儿宁颗粒中10 种成分

刘加元，张建超

（1.湖北省第三人民医院药学部，湖北武汉 430033； 2.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065）

保儿宁颗粒是由炙黄芪、防风、茯苓、炒白术、芦根、鸡内金、炒山药7 味药材加工而成的儿科用中成药，具有益气固表、健中醒脾之功效，用于脾肺气虚所致的神倦纳呆、面黄肌瘦、烦燥不宁、表虚自汗、易感风邪等病症的治疗［1］。研究表明，它能显著延长小鼠缺氧情况下的存活时间，增加小鼠体体质量和食欲［2］；对小儿反复呼吸道感染疗效显著［3］，可增加呼吸道免疫功能［4］，对哮喘合并反复呼吸道感染引起免疫功能紊乱的疗效明显［5］，有效改善变应性鼻炎合并哮喘患儿免疫功能，减少呼吸道感染发生，减轻变应性鼻炎和哮喘的临床症状［6］；联合布地奈德、孟鲁司特时，治疗小儿变应性鼻炎临床效果理想［7-12］，而联合利巴韦林、阿昔洛韦时，能明显提高反复呼吸道感染患儿身体抵抗力［13］。

保儿宁颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》 （中药成方制剂第十五册）［1］，但未对方中成分进行定量分析，前期文献也仅涉及其所含的黄芪甲苷、升麻素苷［14-15］。中药及其复方制剂成分复杂，单一成分难以全面评价其质量，多组分质量控制模式已逐渐应用于相关检测中。本实验采用HPLC 法对保儿宁颗粒中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含有量同时进行测定，以期为该制剂多指标成分控制和质量标准完善提供参考依据。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AB135-S 型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号111920-201606，纯度97.6%）、升麻素苷（批号111522-201712，纯度96.2%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201811，纯度97.4%） 对照品均购于中国食品药品检定研究院；亥茅酚苷（批号15012605，纯度96.9%）、去氢茯苓酸（批号14032101，纯度 99.4%）、茯苓酸 （批号15030404，纯度98.6%） 对照品均购于成都普瑞法科技开发有限公司；芒柄花苷（批号17081841，纯度98.2%）、芒柄花素（批号16122221，纯度99.0%）、升麻素（批号18042043，纯度99.8%）、去氢土莫酸（批号17091513，纯度98.2%） 对照品均购于上海同田生物技术股份有限公司；缺炙黄芪、缺防风、缺茯苓、缺炒白术、缺芦根、缺鸡内金、缺炒山药阴性样品均购于武汉市神草中药饮片有限责任公司，经湖北中医药大学张建超副教授鉴定为正品，按相关质量标准检验均符合规定。保儿宁颗粒（每袋装10 g，批号20180709、20181002、20190304） 购于贵州百灵企业集团正鑫药业有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Extend XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相［乙腈-甲醇（9∶1）］（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～13.0 min，35.0% A；13.0～34.0 min，35.0%～44.0%A；34.0～55.0 min，44.0%～70.0%A；55.0～69.0 min，70.0%～92.0% A；69.0～75.0 min，92.0%～35.0% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长254 nm （0～55.0 min，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷）［16-18］、210 nm （55.0～75.0 min，去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸）［19-20］；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇溶解稀释成分别含毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸1.116、0.784、1.468、3.592、1.024、1.956、0.832、0.356、0.264、0.428 mg／mL的贮备液，各精密量取2.5 mL，置于同一100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（各成分含有量分别为27.9、19.6、36.7、89.8、25.6、48.9、20.8、8.9、6.6、10.7 μg／mL）。

2.3 供试品溶液 取颗粒适量，研细，取粉末约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，称定质量，超声 （200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液 按处方比例及工艺，分别制备缺炙黄芪、缺防风、缺茯苓的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 系统适应性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰基线平稳，峰形对称，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均低于4 000，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 个25 mL 量瓶中，甲醇依次稀释成20 倍质量浓度差的溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度试验 取“2.2”项对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为 0.63%、1.11%、0.76%、0.59%、1.02%、1.17%、0.80%、1.25%、1.39%、1.05%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批颗粒适量，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分别为1.02%、1.66%、1.24%、0.97%、1.57%、0.43%、1.39%、1.78%、0.86%、1.70%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为0.59%、1.08%、0.72%、0.61%、0.99%、1.23%、0.85%、1.19%、1.44%、1.10%，表明溶液在18 h 内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取同一批各成分含有量已知的颗粒适量，研细，取9 份，每3 份为1 组，每份约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按照2015 年版《中国药典》 四部要求，将高、中、低质量浓度对照品溶液加入量与供试品溶液中待测成分含有量的比例分别控制在1.5∶1、1∶1、0.5∶1，精密加入对照品溶液（含毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 0.338 mg／mL、芒柄花苷0.218 mg／mL、芒柄花素0.473 mg／mL、升麻素苷1.123 mg／mL、升麻素0.327 mg／mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷 0.639 mg／mL、亥茅酚苷0.287 mg／mL、去氢土莫酸0.119 mg／mL、去氢茯苓酸0.082 mg／mL、茯苓酸0.159 mg／mL） 0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸平均加样回收率分别为98.41%、97.65%、99.08%、100.01%、98.10%、99.94%、98.29%、97.34%、96.91%、97.93%，RSD 分别为1.21%、1.53%、0.93%、0.77%、1.39%、0.66%、1.65%、1.41%、0.96%、1.14%。

2.6 样品含有量测定 取3 批颗粒，研细，取约2.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分选择 保儿宁颗粒中黄芪补脾益肺，固表止汗，而白术健脾扶正，补中焦而滋气血之源，合为君药；山药健脾补肺，益肾填精，而茯苓渗湿健脾，宁心安神，可增芪术之效，合为臣药；防风祛风邪，而芦根防久补生热，合为佐药；鸡内金和胃健脾，为使药，诸药合用，共奏益气固表、健中醒脾之功效。参考中药质量标志物以君药为主，臣、佐、使药兼顾的确定原则［21-24］，本实验选择方中炙黄芪所含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，茯苓所含去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，防风所含升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷作为指标成分，可实现保儿宁颗粒中多成分的质量控制。

3.2 供试品溶液制备方法选择 本实验首先考察了提取溶剂（50%甲醇［17］、甲醇［16，18-20，25］、50%乙醇、乙醇），发现以甲醇为提取溶剂时各成分综合提取率最佳，再考察了提取方式（超声［16，19-20，25］、加热回流［17-18］）、提取时间 （15 min、30 min、45 min）对各成分综合提取效果的影响。最终，确定甲醇超声提取30 min 作为供试品溶液制备方法。

3.3 流动相选择 本实验首先采用不同比例甲醇-水、乙腈-水梯度洗脱，发现无法兼顾各成分的分离度、峰形、出峰时间。参考文献［25］，以乙腈-甲醇（9∶1） 与水为流动相进行梯度洗脱，发现上述情况有了明显改善，但色谱图基线仍存在漂移现象，并且检测时间长，芒柄花苷、去氢茯苓酸存在拖尾，故又在水相中加入适量酸（0.1%甲酸［16］、0.1%磷酸［19-20］、0.1% 冰醋酸），同时对流动相比例不断调整。最终，确定乙腈-甲醇 （9∶1） 与0.1%甲酸作为流动相，按“2.1”项下比例进行梯度洗脱。

4 结论

本实验首次建立HPLC 法同时测定保儿宁颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含有量，发现该方法简便可靠，检测时间短，可为该制剂质量控制和综合评价提供依据。