HPLC 法同时测定藤黄健骨胶囊中9 种成分

陈海燕，刘华东*，李 冰，韦素华

（1.广西卫生职业技术学院，广西南宁 530023； 2.广西明合药业有限责任公司，广西南宁 530020）

藤黄健骨胶囊现收录于《国家食品药品监督管理总局药品标准》 （YBZ06272008），由熟地黄、鸡血藤、淫羊藿、鹿衔草、肉苁蓉、炒莱菔子、烫骨碎补7 味药材加工而成，具有补肾、活血、止痛的功效，临床上主要用于肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎、大骨节病等病症的治疗［1］，对肾虚血瘀型骨质疏松症［2］、腰椎间盘突出症［3］、腰椎骨折合并严重骨质疏松症［4］、椎动脉型颈椎病［5］、原发性骨质疏松症［6］、骨性关节炎［7］、早期四肢骨折［8］、腰肌劳损［9］等疾病的临床疗效显著。但目前该制剂现行质量标准和文献［10-11］仅对方中臣药淫羊藿所含淫羊藿苷进行定量分析，尚无多组分含有量测定的报道。因此，本实验采用HPLC 法同时测定藤黄健骨胶囊中君药熟地黄活性成分梓醇、地黄苷D、益母草苷，臣药淫羊藿活性成分淫羊藿苷、宝藿苷I，佐药鸡血藤活性成分儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素的含有量，建立该制剂多指标成分的质量控制模式，以期为全面评价其质量提供数据支持。

1 材料

Dionex UltiMate3000 型高效液相色谱仪 （美国Thermo Fisher 公司）；BS110S 型电子分析天平（德国Sartorious 公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。儿茶素（批号110877-201604，纯度99.2%）、表儿茶素（批号110878-201703，纯度99.7%）、淫羊藿苷（批号110737-201516，纯度94.2%）、宝藿苷I（批号111852-201603，纯度99.9%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；地黄苷D （批号14061708，纯度98.8%） 对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；梓醇（批号17071021，纯度98.6%）、益母草苷（批号18052422，纯度94.6%）、甘草素（批号18111522，纯度99.4%）、美迪紫檀素（批号18040322，纯度100.0%） 对照品均购自上海同田生物技术股份有限公司。熟地黄、鸡血藤、淫羊藿、鹿衔草、肉苁蓉、炒莱菔子、烫骨碎补均购自广西岑溪市安阳堂药业有限公司，经广西卫生职业技术学院陈海燕讲师鉴定为正品，按2015 年版《中国药典》 一部各药材质量标准检验均符合相关规定。藤黄健骨胶囊 （每粒装0.25 g，批号181104、190105、190406） 购于甘肃省西峰制药有限责任公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～10.0 min，5.0%A；10.0～25.0 min，5.0%～10.0% A；25.0～47.0 min，10.0% →39.0% A；47.0～63.0 min，39.0%～45.0%A；63.0～70.0 min，45.0%～5.0%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；0～25.0 min在210 nm 波长处检测梓醇、地黄苷D、益母草苷［12-13］，25.0～47.0 min 在280 nm 波长处检测儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素［14-15］，47.0～70.0 min 在270 nm 波长处检测淫羊藿苷、宝藿苷I［1，10-11，16-17］；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷和宝藿苷I 对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为2.178、0.982、1.354、0.918、1.212、0.108、0.136、3.012、1.988 mg／mL 的贮备液，各精密量取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（含梓醇108.9 μg／mL、地黄苷D 49.1 μg／mL、益母草苷67.7 μg／mL、儿茶素45.9 μg／mL、表儿茶素60.6 μg／mL、甘草素5.4 μg／mL、美迪紫檀素6.8 μg／mL、淫羊藿苷150.6 μg／mL、宝藿苷I 99.4 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取胶囊20 粒，倾出内容物，研细混匀后精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声（300 W、40 kHz） 提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按胶囊处方比例和生产工艺，分别制备缺熟地黄、缺鸡血藤、缺淫羊藿的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，色谱图基线平稳，各成分与其他杂质峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均不低于3 500，阴性无干扰。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 个20 mL 量瓶中，甲醇制成6 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为 0.77%、0.95%、0.78%、0.81%、0.99%、1.12%、1.06%、0.51%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批胶囊，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为1.02%、1.35%、1.20%、1.47%、1.19%、0.85%、1.79%、0.97%、1.06%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备1份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 峰面积RSD 分别为0.79%、0.96%、0.75%、0.86%、1.03%、1.11%、1.07%、0.53%、0.67%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 加样回收率试验 精密称取梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 含有量已知 （1.478、0.656、0.894、0.536、0.722、0.058、0.072、2.124、1.198 mg／mL） 的胶囊内容物9 份，每份1.0 g，置于具塞锥形瓶中，按照2015 年版《中国药典》 规定加入对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 平均加样回收率分别为99.71%、98.91%、99.26%、97.94%、98.32%、96.97%、96.95%、100.01%、98.96%，RSD 分别为 0.83%、0.96%、1.09%、1.45%、1.32%、0.99%、1.17%、0.76%、1.25%。

2.9 样品含有量测定 取3 批胶囊，按“2.2.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／粒， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／capsule， n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选 藤黄健骨胶囊中熟地黄补血滋阴，益精填髓，为君药，梓醇、益母草苷、地黄苷D 等环烯醚萜苷类为其主要活性成分；淫羊藿补肾阳，强筋骨，祛风湿，为臣药，淫羊藿苷、宝藿苷I 等黄酮类为其主要活性成分；鸡血藤活血补血，舒筋活络，为佐药，儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素等黄酮类为其主要活性成分。根据中药质量标志物确认原则，本实验选择梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 作为指标成分。

3.2 供试品溶液制备方法筛选 本实验首先考察不同提取溶剂（甲醇［10，13，16］、50%甲醇［12］、乙醇、50%乙醇［1，11，15，17］） 对藤黄健骨胶囊中9 种成分综合提取率的影响，发现甲醇提取时最高，色谱图中杂质峰数量少。再考察不同提取方式（超声提取法［1，10-14］、回流提取法［15］、索氏提取法），发现各成分综合提取率差异不大，考虑到制备便捷性和结果准确性，采用超声提取。最后考察不同提取时间（30、60、90 min）。最终确定，供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

3.3 流动相筛选 本实验考察乙腈-水［1，10-12，16-17］、乙腈-0.2%磷酸［13-14］、乙腈-0.1%甲酸［15］流动相体系，发现以乙腈-0.2%磷酸洗脱时色谱峰分离度较好，基线平稳，故选择其作为流动相。进一步对流动相比例进行优化，最终确定为“2.1”项下梯度洗脱程序。

4 结论

本实验首次采用HPLC 法同时测定藤黄健骨胶囊中梓醇、地黄苷D、益母草苷、儿茶素、表儿茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、宝藿苷I 的含有量，再按照2015 年版《中国药典》 四部药品质量标准分析方法验证指导原则进行验证。结果发现，该方法操作便捷，结果准确，重复性好，可用于该制剂的质量控制。