乌腺金丝桃-丹参药对提取工艺的优化

李永鑫，高彦宇，李文慧，沈芳玲，李 冀

（黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨 150040）

乌腺金丝桃为藤黄科金丝桃属植物，其味苦，性平，归心经，可用于治疗心脏病［1-3］，而丹参为治疗心血管疾病的常用中药，前者功效清心泻火除烦，后者功效活血凉血安神，两药配伍，对心火亢盛、瘀血阻滞者尤佳。本实验在乌腺金丝桃-丹参药对前期临床及药理实验［4-7］的基础上，采用Box-Behnken 响应面法优化其提取工艺，并参考2015年版《中国药典》［8］测定金丝桃苷、丹参酮ⅡA含有量，以期为后续研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Nexera X2 LC30-A、Nexera X2 SIL-30AC、Nexera X2 SPD-M30A 超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AL204 电子分析天平（万分之一）；SK5200HP 超声波清洗器；Millipore 纯水仪；RE-2000 旋转蒸发仪；HH-501 型恒温水浴锅；MIKRO 220R 超高速低温离心机。

1.2 试剂与药物 乌腺金丝桃由吉林农业科技学院提供，丹参购自市场，均经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为正品。金丝桃苷对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-16102605，纯度≥99%）；丹参酮ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院，批号6GYZ-4GE2，纯度≥99%）。磷酸为优级纯，乙腈、甲醇为色谱纯，均购自美国Sigma公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack XR-ODS Ⅱ色谱柱（2.0 mm×100 mm，2.2 μm）；流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脱 （0～1 min，10%～15%B；1～6 min，15%～19%B；6～8 min，19%～25% B；8～18 min，25%～50% B；18～23 min，50%～65% B；23～25 min，65%～80% B；25～30 min，80%～100%B）；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；检测波长270 nm （丹参酮ⅡA）、360 nm（金丝桃苷）。色谱图见图1。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备 精密称取金丝桃苷对照品1.2 mg、丹参酮ⅡA对照品6.0 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇超声溶解后定容至刻度，各取5 mL 于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（金丝桃苷、丹参酮ⅡA质量浓度分别为24、120 μg／mL）。

2.3 供试品溶液制备 按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，回流提取后提取液定容至300 mL，取10 mL 上清液减压浓缩至干，甲醇溶解，4 ℃、6 000 r／min 下离心10 min，滤液置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm 有机滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取“2.2”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得金丝桃苷、丹参酮ⅡA方程分别为Y＝24 314X-1 191.1 （R2＝0.998 9）、Y＝61 911X＋39 305 （R2＝0.998 4），分别在2.4～21.6、12～108 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定5 次，测得金丝桃苷、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为0.86%、1.25%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、3、6、9、12 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为1.82%、2.56%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批药材5 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定，测得金丝桃苷、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为1.77%、2.01%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取各成分含有量已知的供试品溶液3 组，每组平行2 份，按80%、100%、120%水平加入对照品，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，金丝桃苷、丹参酮ⅡA平均加样回收率分别为98.55%、100.33%，RSD 分别为1.59%、2.01%。

2.5 单因素试验 以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数为影响因素，金丝桃苷、丹参酮ⅡA含有量为评价指标，权重系数分别设定为1、2，计算综合评分（Y），公式为Y＝ （金丝桃苷含有量／最大值） ×100×1×1／3＋（丹参酮ⅡA含有量／最大值） ×100×2×1／3。

2.5.1 乙醇体积分数 按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，固定料液比1∶10，提取时间1 h，提取次数1 次，考察乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%对综合评分的影响，结果见图2。由此可知，80% 乙醇提取时综合评分最高，故选择70%、80%、90%作进一步研究。

2.5.2 料液比 按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，固定乙醇体积分数80%，提取时间1 h，提取次数1 次，考察料液比1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 对综合评分的影响，结果见图2。由此可知，料液比1∶12 提取时综合评分最高，故选择1∶8、1∶12、1∶16 作进一步研究。

2.5.3 提取时间 按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，固定乙醇体积分数80%，料液比1∶12，提取次数1 次，考察提取时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 对综合评分的影响，结果见图2。由此可知，提取2 h 时综合评分最高，故选择1.5、2.0、2.5 h 作进一步研究。

2.5.4 提取次数 按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，固定乙醇体积分数80%，料液比1∶12，提取时间2 h，考察提取次数1、2、3 次对综合评分的影响，结果见图2。由此可知，随着提取次数增加综合评分升高，但提取2 次或3 次无明显差异，考虑到工业生产实际情况，故选择2 次。

图2 各因素对综合评分的影响Fig.2 Effects of various factors on comprehensive score

2.6 Box-Behnken 响应面法 根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C） 作为影响因素，金丝桃苷、丹参酮ⅡA含有量作为评价指标，按“2.5”项下方法计算综合评分（Y）。因素水平见表1，结果见表2。

通过Design-Expert 8.0.6 软件进行拟合，得方程为Y＝91.88 ＋1.19A＋7.71B-1.06C＋0.72AB＋1.73AC-2.05BC-5.46A2-9.26B2-1.60C2（R2＝0.920 1），方差分析见表3。由此可知，因素B、A2、B2有显著影响（P＜0.05）；模型P＜0.05，失拟项P＞0.05，表明方程拟合度较高，预测性较好。响应面分析见图3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图3 各因素响应面图Fig.3 Response surface plots for various factors

2.7 验证试验 通过Design Expert 8.0.软件，得到最优工艺为加入13.87 倍量80.52% 乙醇提取1.74 h，根据实际生产，将其修正为加入14 倍量80%乙醇提取1.75 h，综合评分94.09。按1∶2 比例称取乌腺金丝桃、丹参共30 g，在上述优化工艺下进行3 批验证试验，测得综合评分平均值为93.22，与预测值94.09 接近，表明工艺稳定合理。

3 讨论

金丝桃苷为乌腺金丝桃主要黄酮类成分［9］，具有抗心肌脂质过氧化的作用［10-11］；丹参主要脂溶性成分为丹参酮，其中丹参酮ⅡA含有量最高，具有保护心肌、扩张冠脉、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗动脉粥样硬化等活性［12-14］。课题组前期研究表明，乌腺金丝桃-丹参药对活性部位可抗心肌缺血再灌注损伤，两者最佳配伍比例为1∶2［15］。本实验参考2015 年版《中国药典》，选择金丝桃苷、丹参酮ⅡA作为评价指标对该药对提取工艺进行优化。

由于投料量过小不利于工艺考察，故本实验将药材制成粗粉提取，可减少质地不均造成的影响。考虑到金丝桃苷、丹参酮ⅡA紫外最大吸收波长不同，本实验采用全波长扫描；流动相考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸，发现乙腈-0.1%磷酸分离效果最好。

本实验先通过单因素试验筛选响应面范围，并参考药对配伍比例及指标成分含有量设置评分权重，再通过Box-Behnken 响应面法优化乌腺金丝桃-丹参药对提取工艺。结果表明，上述方法可用于该药对脂溶性成分的提取，能为其后续质量标准及药理活性的研究提供依据。