尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测方法的建立及性能评价

李奎，刘啸林，于林，李双法，丁蒙蒙，刘珂，付光宇(.郑州安图生物工程股份有限公司，郑州 45006；.河南大学生命科学学院，河南开封47500)

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)作为一种新型敏感的肾损伤标志物备受关注[1]。正常情况下，NGAL由肾脏少量表达，在肾脏损伤前期，肾小球缺血2 h内显著升高[2]。研究表明，尿NGAL比血、尿肌酐更能特异性地反映急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的损伤程度[3]。NGAL可以作为AKI早期诊断的一个敏感指标[4]。

目前NGAL的检测方法主要有化学发光法、免疫比浊法、ELISA等，如美国Abbott化学发光法、丹麦BioPorto比浊法及美国R&D System的ELISA法等[5]。Kift等[6]研究显示，化学发光法与比浊法具有比ELISA方法更宽的检测范围和灵敏度。另有研究报道，不同方法学NGAL参考范围及其AKI判断临界值各不相同，差异较大[7-9]。本实验采用化学发光法定量检测人尿液中NGAL的含量，为AKI的诊断和患者治疗监测提供辅助手段。

1 材料与方法

1.1标本来源及处理 收集2019年3至7月河南省人民医院住院患者尿液标本204份，另收集203份同期健康者尿液标本。尿液标本400×g离心5 min，取上清液于-20 ℃保存备用。

1.2主要仪器与试剂 AutoLumo A2000 plus全自动化学发光测定仪(郑州安图生物公司)，ARCHITECTi2000SR全自动免疫分析仪(美国Abbott 公司)；尿NGAL测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法，批号89159U100，美国Abbott 公司)，小鼠抗人NGAL单克隆抗体(克隆号5A6、2H5)、NGAL天然纯化抗原、辣根过氧化物酶(郑州伊美诺公司)，发光底物A(鲁米诺)、发光底物B(H2O2)(郑州安图生物公司)，磁珠(粒径1.0 μm，粒径变异系数<5%，JSR Life Sciences公司)，牛血清清蛋白(BSA，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1小鼠抗人NGAL单克隆抗体酶结合物的制备 用过碘酸钠法对小鼠抗人NGAL单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，并通过半饱和硫酸铵法纯化、透析，按体积比1∶1加入50%甘油混匀，于-20 ℃保存。用含10 g/L BSA的0.05 mol/L pH 7.4 Tris-NaCl稀释液将酶结合物稀释为不同比例。

1.3.2磁微粒包被抗体的制备 将500 μg的磁珠原液加入300 μL 0.1 mol/L pH 5.0的MES包被缓冲液中反复吹打混匀，置于磁珠分离器上吸弃上清液，重复3次，等比加入碳二亚胺和sulfo-NHS活化，室温反应1 h，置于磁珠分离器上吸弃上清液，分别加入小鼠抗人NGAL单克隆抗体30 μg、60 μg、120 μg偶联过夜，偶联结束后，置于磁珠分离器上吸弃上清液后加入含20 g/L BSA的0.05 mol/L pH 7.4 Tris-NaCl封闭保护液，混匀后置于磁珠分离器，弃上清液，重复5次后，最后加入封闭保护液定容至3 mL，得到包被抗体浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的磁微粒混悬液，置于2～8 ℃保存。

1.3.3校准品制备及赋值 NGAL无国家标准品或国际标准品，根据GB/T 21415-2008描述，校准品结果溯源至ARCHITECTi2000SR系统。校准品稀释液为含20 g/L BSA的0.2 mol/L pH 7.4 PBS，无基质效应。将NGAL抗原用校准品稀释液配制成不同浓度，浓度分别接近0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、1 500 ng/mL，分装保存于-20 ℃。

用ARCHITECTi2000SR系统及配套尿NGAL测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)对上述制备的校准品进行赋值，并用赋值后的校准品和建立的尿NGAL磁微粒化学发光法同时定标，建立标准曲线，同步测定20份临床梯度浓度尿液样本。将得到的两组结果值进行线性回归，确定两者测定结果的偏倚程度。

1.3.4磁微粒化学发光法检测NGAL 准备测试样本(校准品或待测样本)并正确放置AutoLumo A2000 plus试剂位，点击启动按钮进行定标程序或样本检测程序。执行定标程序时，完成20 μL校准品(0、9.8、100.1、498.5、999.3、1 490.6 ng/mL)、20 μL磁微粒混悬液(20 μg/mL)、50 μL酶结合物(1∶3 000稀释)、50 μL样本稀释液的分注；执行样本检测程序时，用样本稀释液按体积比1∶9稀释待测样本，完成20 μL稀释后样本、20 μL磁微粒混悬液(20 μg/mL)、50 μL酶结合物(1∶3 000稀释)、50 μL样本稀释液的分注。反应液混匀后37 ℃温育15 min，用清洗液对反应液进行清洗分离，完成50 μL底物A液和50 μL底物B液的分注，将反应液混匀，检测发光强度。仪器自动操作系统通过存储的四参数Logistic拟合的定标曲线及样本测试的发光信号值计算样本测试结果。

1.4统计学分析 线性拟合采用Excel软件进行，性能评价按照EP文件的实验要求，实验结果采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。

2 实验与结果

2.1抗体效价确定 酶结合物稀释比例为1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000，磁微粒包被抗体浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL，相互组合方阵实验，考核不同浓度样本，酶结合物稀释比例1∶3 000、磁珠包被浓度20 μg/mL时发光值最大，最终确定该浓度为工作浓度。

2.2标准曲线 通过临床样本及ARCHITECTi2000SR系统对校准品赋值，以校准品浓度为X、发光值lg为Y，建立四参数Logistic曲线拟合数学模型，函数方程为Y=(9.57-4.27)/[1+(X/22.6)-0.4]+4.27，r2=0.999 96，见图1。本方法与ARCHITECTi2000SR系统检测20份临床样本的结果相关性良好,r2=0.999 4,斜率为0.996 9，校准品赋值偏倚在10%以内。

2.3分析性能评估

2.3.2线性范围 按照CLSI标准EP6-A方法，建立本试剂盒的线性范围。10份浓度约为2 000 ng/mL的临床高值样本和1份浓度接近0的低值样本按照不同比例混合，制备10组系列浓度的样本，每个样本重复测定4次，求其平均值，对各组数据进行多项回归分析。实验结果表明，10组样本在10～1 500 ng/mL浓度范围内，每个样本的实际测定浓度与理论浓度相对偏差均小于10%，回归方程的r2均大于0.990，斜率1.0±0.5，因此本研究建立的NGAL检测方法在10～1 500 ng/mL范围内线性良好。

2.3.3精密度 按照EP5-A2的方法分别测定高(750.8 ng/mL)、中(228.6 ng/mL)、低(47.6 ng/mL)浓度精密度质控品样本3份，各重复测定20次，计算分析内变异。3份精密度质控品样本每天各检测2次，每次2个重复，2次检测之间至少间隔2 h。连续检测20 d，每天改变精密度样本的检测顺序，利用MVS软件计算分析间变异(天间变异)。结果显示，分析内精密度(CV)、分析间精密度(CV)均小于8%，具有良好的精密度。见表1。

表1 分析内和分析间精密度实验结果

2.3.4干扰试验 取高、低浓度样本分别按一定浓度添加干扰物血红蛋白、三酰甘油、胆红素(DMSO溶解)、抗坏血酸、肌酐、尿素进行测定，重复3次，计算平均值和干扰率。干扰率=[(干扰样本浓度-对照样本浓度)-(溶剂样本浓度-对照样本浓度)]/对照样本浓度×100%。结果显示，100 mg/dL血红蛋白、3 000 mg/dL三酰甘油、50 mg/dL胆红素、10 mg/dL抗坏血酸、1 000 mg/dL肌酐、12.5 g/dL尿素的干扰率均小于10%，对检测体系干扰不明显。见表2。

表2 添加干扰物对检测结果的影响

2.4参考值范围确定 依据《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——参考值(参考区间)(征求意见稿)》，用本方法试剂测定河南省人民医院检验科203份健康人尿液样本，并分析NGAL水平的分布情况，结果见图2。203份健康人群尿液NGAL水平呈偏态分布，采用第95位百分位数法确定本方法参考区间为0～111.08 ng/mL。

2.5准确度

2.5.1回收率 根据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则(征求意见稿)》文件进行试剂盒的回收率评估。选择高值样本5份，按照体积比1∶9分别加入5份基质标本中，即加入高值样本体积0.1 mL，基质样本体积0.9 mL，制成回收标本，每个回收样本重复检测3次，求均值，计算回收率。回收率R=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% (V0：低值标本的体积，VS：高值标本的体积，C：回收标本的检测浓度，C0：低值标本的检测浓度，CS：高值标本的检测浓度)。结果表明，本方法检测5份样本的回收率均为90.9%～103.1%。见表3。

表3 回收试验结果

2.5.2方法学比对 2种方法同时检测204例新鲜临床尿液样本，ARCHITECTi2000SR系统检测样本浓度范围为18.9～1 460 ng/mL。以 ARCHITECTi2000SR系统NGAL检测试剂结果为X轴，以安图磁微粒化学发光NGAL检测试剂结果为Y轴，相关性拟合曲线为Y=1.038 7X-9.834 6，r=0.990 5，用SPSS软件进行线性回归统计，斜率b对应P>0.05，说明斜率与1差异无统计学意义，相关性良好，见图3。

ARCHITECTi2000SR系统NGAL检测试剂参考值范围第95百分位数≤131.7 ng/mL，本方法参考值范围为0～111.08 ng/mL，定性分析结果见表4。临床样本两法检测结果的阳性符合率为96.9%(94/97)，阴性符合率为95.3%(102/107)，总符合率为96.1%。经Kappa系数检验，k=0.922，P<0.001，说明本方法与ARCHITECTi2000SR系统NGAL检测试剂吻合度有统计学意义且具有高度的一致性。

表4 安图与Abbott NGAL试剂检测临床样本的结果符合率

3 讨论

本方法的空白限为0.1 ng/mL，线性范围为10～1 500 ng/mL，分析内、分析间精密度不高于8%，满足临床患者NGAL定量检测分析。血红蛋白、三酰甘油、胆红素、抗坏血酸、肌酐、尿素等尿液中常见干扰物在一定浓度下干扰率均小于10%，对检测结果影响小。试剂回收率在90.9%～103.1%范围内，与Abbott NGAL检测试剂进行方法学对比，临床相关性r=0.990 5，总符合率96.1%，两者具有良好的相关性且一致性高。

本研究建立的NGAL化学发光定量检测方法，搭配全自动化学发光测定仪检测临床尿液样本，具有高通量，线性范围宽、高精密度和高特异性等优点，可满足临床患者NGAL的定量分析，为AKI、慢性肾病等患者提供治疗效果监测及诊断辅助手段。