新型冠状病毒核酸和抗体联合检测的应用价值*

陈伟，吴成就，彭丽，梁剑琦，朱爱民，黄小晔(娄底市中心医院检验科，湖南娄底 417000)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传染性极强的急性传染病，早发现传染源并进行隔离治疗，是防治COVID-19的重要手段。新型冠状病毒肺炎诊疗方案一直以来均推荐实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性作为疑似病例确诊的诊断条件之一，但实时荧光RT-PCR技术对实验场所及人员要求高、操作繁琐、耗时长、检测人员感染风险高、结果受标本质量、病毒感染部位及表达量等因素影响较大[1]。血清特异性抗体检测的操作简单便捷，仅需采集血液标本，很大程度上降低医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险，是快速筛查和辅助诊断的重要手段[2]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》已将血清学抗体检测列入疑似病例确诊的诊断条件之一[3]。鉴于2种检测方法各自的特点，将核酸检测和血清学检测相结合可提高检出率，不同类型患者可选择不同的检测方法。

1 资料和方法

1.1标本来源 收集2020年2月1日至2020年3月15日本院感染科隔离病房入院的26例确诊COVID-19患者的咽拭子和血清标本。确诊标准[3]：(1)有相应流行病学史；(2)有相关临床表现(发热和/或呼吸道症状、具有COVID-19影像学特征等)；(3)实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性。其中男性16例，女性10例，年龄(42.0±18.3)岁。分别于确诊后第4、7、15、30和45天采集患者血液标本及咽拭子(对已出院患者进行回访并在相应时间点采集血液和咽拭子标本)。

1.2仪器与试剂 Vii7-Dx荧光定量 PCR仪(ABI公司)；SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(湖南圣湘公司)，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测试剂盒(胶体金免疫层析法，康华公司)。

1.3SARS-CoV-2核酸检测(实时荧光RT-PCR法) 待测标本56 ℃灭活30 min后，用SARS-CoV-2核酸检测试剂盒提取核酸，按照一步法试剂盒说明书配制反应体系：26 μL反应液，4 μL酶，20 μL核酸，共50 μL。反应参数：50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45个循环。用Vii7-Dx荧光定量 PCR仪检测，荧光通道选择：VIC(内标基因)、FAM(ORF1ab基因)、ROX(N基因)。结果判定：FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且循环阈值(Ct)≤40为阳性；FAM、ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线，仅VIC通道有扩增曲线且Ct≤40为阴性。一步法检测阳性标本采用伯杰新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)作进一步确认。

1.4SARS-CoV-2血清抗体检测(胶体金免疫层析法) 用捕获法检测血清样本中的IgM抗体，双抗原夹心法检测IgG抗体，标本3 000 r/min 离心10 min后，离心机内静置15 min后取出，二级生物安全柜内开盖。取10 μL待检血清至加样处，随即滴加80 μL样本稀释液至加样处，均于15～30 min后观察结果。根据试剂说明书直接进行肉眼判读，当检测区及质控区各出现一条红色反应线为阳性，仅质控区出现一条红色反应线为阴性。

2 结果

2.1核酸检测转阴后IgM/IgG抗体检出率 26例确诊患者病毒核酸检测转阴时间为(16.3±11.6)d,最短为6 d，最长为45 d(观察截止时间)，转阴当日IgM和IgG的检出率分别65.38%(16/26)和53.85%(14/26)，2种抗体检出率差异无统计学意义(χ2=0.719，P>0.05)。

2.2不同时间点IgM/IgG抗体检出率 根据IgM和IgG抗体产生的一般规律，选择5个时间点作为抗体检测时间(第4、7、15、30、45天)，分析病毒感染后不同类型抗体产生后达到检出限的时间和发展趋势，IgM抗体在确诊后15 d检出率达到65.38%，而IgG抗体为46.15%。IgM抗体最早可在确诊后4 d内检出(19.23%)，并在15 d左右达到峰值后检出率逐渐下降，IgG抗体在确诊后7 d左右可检出(检出率为7.69%)，并随着时间延长检出率持续上升并维持较长时间。见表1和图1。

表1 26例COVID-19患者不同时间点血清抗体检出率(%)

2.3不同时间点内标基因、ORF1ab基因、N基因的Ct值 内标基因在不同患者不同时间点的表达量基本恒定，ORF1ab基因和N基因表达量在一周内出现明显下降，N基因的下降速率明显低于ORF1ab基因。到观察截止时间点(45 d)仍有1例ORF1ab基因阳性(Ct为38.05)和5例N基因阳性(Ct为35.47±3.12)。见表2。

表2 不同检测时间点SARS-CoV-2核酸检测循环阈值(Ct)结果

3 讨论

鉴于SARS-CoV-2的高传染性，控制疫情蔓延最有力措施就是对确诊患者的早发现、早诊断、早隔离、早治疗，国家推荐核酸检测为新冠病毒肝炎确诊的金标准，但同时核酸检测也可因为采集部位、方法、病程等因素的影响而出现假阴性结果[4-5]。胶体金免疫层析法具有快速、操作简便等特点，相比核酸检测，具有成本较低、对操作人员技术要求不高、无需特殊仪器、试剂稳定等优点，适合于大面积推广。

IgM抗体是机体在急性期感染时较早出现的抗体，亲和力较低，持续时间短。IgG抗体是再次免疫应答产生的抗体，亲和力较强，持续时间长，提示既往感染或是病程中后期。目前，COVID-19患者的体液免疫应答机制尚未完全明确，但其抗体变化规律与一般病毒感染存在一定的相似性[6-7]，SARS-CoV-2特异性IgM多在发病后3～5 d出现阳性。来自武汉的研究显示：COVID-19患者IgM和IgG抗体检测的敏感性分别为70.24%和96.10%，抗体检出率较高[8]。本研究根据病毒感染的特异性IgM抗体和IgG抗体的产生规律，选择5个时间点作为检测时间(第4、7、15、30、45天)，分析病毒感染后不同类型抗体产生后达到检出限的时间和发展趋势，IgM抗体在确诊后15 d检出率达到65.38%，而IgG抗体为46.15%，IgM抗体最早可在确诊4 d内检出，并在15 d左右达到峰值后逐渐下降，IgG抗体在7 d左右可检出，并随着时间延长检出率持续上升并维持较长时间。

SARS-CoV-2基因组含有约29 000个碱基，有 12 个蛋白质编码区/开放读码框(ORF)，其中ORF1ab基因为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制[9]；N基因编码核衣壳蛋白，是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、病毒组装过程中与其他蛋白质结合等特征。有研究表明确诊病例和无症状感染者第3周这2个基因的Ct值高于第2周，提示病程的进展、相关诊疗手段的实施，病毒载量随着时间的延长而下降[10]。本研究中发现，病毒2个基因的表达量随着病程的进展下降程度不一样。ORF1ab基因表达量在一周内明显下降，而N基因的下降速率明显减慢，观察结束时N基因的检出率高于ORF1ab基因，可能与2种基因编码的蛋白质功能不同有关，治疗过程中与病毒复制有关的ORF1ab基因表达受到明显的抑制，而对核衣壳蛋白编码基因(N基因)影响较小。N基因的持续表达对机体免疫系统产生持续的免疫刺激，从而提高抗体的产生效率。

核酸检测和血清抗体检测各有优劣：核酸检测成本高、技术要求高且费时，标本采样、病毒灭活、核酸提取等过程对核酸检测结果影响较大，容易出现假阴性；而血清抗体检测因检测时间短、操作简便、具有较高的敏感性和特异性。本研究发现在感染早期(7 d内)核酸检测检出率较高，IgM抗体开始产生并且检出率持续升高，而病程中后期IgM和IgG抗体的检出率明显高于核酸检测。因此，可以将2种方法有效结合起来，以核酸检测为主并辅以抗体检测，以判断感染早期、既往感染和无症状感染者。