不同谱系节节麦的杂种优势分析

苏 晴,赵梦雨,刘颉尧,宋思宇,吴 潇,蒋 政,董浩然,李玉阁,李锁平

(河南大学生命科学学院，河南开封 475004)

利用杂种优势提高作物产量、品质、适应性和抗逆性，是作物遗传改良的重要途径。杂交小麦是今后大幅度提高小麦产量的首选途径[1]。小麦的遗传基础日益狭窄，限制了其杂种优势利用和遗传改良[2-3]。从野生近缘物种中发掘有益基因资源并将其导入普通小麦，是当前通过杂交育种改良普通小麦的主要途径[4-5]。节节麦(AegilopstauschiiCoss.2n=2x=14，DD)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)山羊草属(Aegilops)的一年生草本植物，是公认的普通六倍体小麦(TriticuvumaestivumL. 2n=6x=42，AABBDD)D基因组的二倍体供体[6]。根据穗型等形态学特征，Hammer[7]将节节麦划分为 ssp.tauschii和ssp.strangulala两个亚种。根据其生态习性，节节麦可分为杂草型和野生型；前者通常以田间杂草的形式分布于小麦主产区的田间地头，后者则通常以自然群落形式存在于伊朗、阿富汗南部、巴基斯坦和我国新疆伊犁地区[8]。Mizuno等[9]、Sohail等[10]、Wang等[11]和Singh等[12]分别采用AFLP、DArT、SNPs分子标记技术，根据节节麦的种群遗传结构特征，将世界分布的节节麦清晰地划分为L1(lineage 1)和L2(lineage 2)两大谱系。L1谱系主要是土耳其、萨尔维亚、阿富汗和中国黄淮麦区(河南、陕西)等东部分布区的杂草型节节麦，L2谱系则主要是伊朗、阿富汗南部、巴基斯坦、中国新疆伊犁地区等西部分布区的野生型节节麦。研究表明，仅有少数隶属于L2谱系、2-3亚系、ssp.strangulala亚种的节节麦参与了普通小麦的形成[9-10]。而具有比普通小麦D基因组更广泛遗传变异而没有参与普通小麦起源的L1谱系节节麦，可能是对小麦遗传改良有重要应用价值的宝贵野生种质资源[13]。目前，已从节节麦中发掘出大量优质、抗病、抗逆等对普通小麦遗传改良有应用价值的有益基因，部分基因已通过直接或间接途径导入普通小麦[14-23]。

在地理分布上存在隔离的两大谱系节节麦，在遗传组成上也存在明显的遗传分化，很少存在中间过度类型的节节麦[9]。说明两个谱系的节节麦在自然条件下是隔离生殖的[11]，对L1和L2谱系节节麦是否已形成遗传学意义上的生殖隔离、是否存在显著的杂种优势，目前尚不明确。

本研究拟对L1和L2谱系节节麦进行人工杂交，结合SSR分子标记、花粉活力测定、染色体减数分裂的配对情况及其16个主要农艺性状的调查，比较L1和L2谱系节节麦的遗传差异和杂种优势，为其在普通小麦育种中的杂种优势利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的国外节节麦由美国国家植物种质中心提供，中国河南、新疆的节节麦则由河南大学植物种质资源与遗传实验室采集并保存。通过预试验，配置成功并种植的14个节节麦杂交组合的材料来源信息见表1。

表1 配置杂交组合、亲本节节麦编号及来源信息表

1.2 试验方法

1.2.1 材料种植

采用完全随机区组设计，每个杂交组合3次重复，每个重复包含父本、杂交种和母本各两行，每行5株(取材及调查性状选取中间3株)，行距为40 cm，株距为25 cm。人工播种，田间管理按照当地常规生产方式进行。

1.2.2 杂种F1真实性鉴定

取5～8叶龄的节节麦叶片(父本和母本各取一株叶片，所有杂交F1均要取材)用于CTAB法提取亲本和子代F1的基因组DNA，选用8对分别位于节节麦不同染色体上的SSR引物(表2)，通过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳[24]、亲本和子代F1电泳条带的组成分析，鉴定杂种F1的真实性。

PCR扩增采用10 μL的反应体系，包含 1 μL 10×PCR缓冲液(Mg2+)，1 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，0.1 μLTaqE(5 U· μL-1)，2 μL DNA模板(30 ng· μL-1)，4.9 μL双蒸水。PCR反应程序为：95 ℃变性3 min；95 ℃变性30 s，退火45 s(Tm见表2)，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃保持 15 min。

表2 鉴定杂种的SSR引物序列

根据鉴定结果，拔除假杂种。

1.2.3 花粉育性的观察和统计

取亲本和杂种F1当天开花的3个小穗，分别取上、中、下部花药，挤出花粉，采用K2-KI溶液染色法进行染色制片和显微镜观察。根据花粉粒染色后的着色深浅、花粉粒的饱满度等特征辨别花粉的育性[25]，取显微镜下的3～5视野的花粉进行观察和计数，求平均值获得花粉活力的百分比，挑取典型的视野拍照留存。

1.2.4 染色体配对情况的观察和统计

从14个杂交组合中随机挑选8个用于同源染色体配对观察。选取3～5个杂种F1减数分裂时期的小穗，将花药剥离并用FAA(醋酸∶酒精=1∶3)固定24 h；通过醋酸洋红染色后制片，显微镜观察，统计并记录F1减数分裂时同源染色体的配对情况，对典型图片进行拍照。

1.2.5 主要农艺性状的调查

通过定性观察，筛选8个F1生长势较优的杂交组合进行主要农艺性状调查。每个重复挑选长势一致的3株，分别对两亲本(P1，P2)和F1的16个农艺性状进行田间调查。用中亲优势指数 (index of heterosis，IH) 和超亲(高值亲本，HP)优势指数(over-parent heterosis，OPH)衡量L1和L2谱系节节麦的杂种优势。

IH=[F1-(P1+P2)/2]/[(P1+P2)/2]×100%

OPH=(F1-HP)/HP×100%

1.3 数据处理

采用单因素方差分析对F1与亲本的差异进行显著性检验，并通过LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 杂种F1真实性的SSR分子标记分析

通过对14个杂交组合父母亲本及其F1进行SSR分子标记检测，发现所有F1条带都兼具两亲本的共有带型，说明F1是真实杂交种。图1展示了部分杂交组合的亲本及其杂交F1的SSR检测结果。

a、b、c、d和e分别代表编号为13、5、1、3和4杂交组合材料。1：父本；2：母本；3：F1。a和b 的引物分别为Xgpw4024和Xcfd132，c～e的引物均为Xgdm61。

2.2 杂种F1代的花粉育性分析

对14个杂交组合的花粉活力进行统计分析，结果(表3)表明，不同节节麦的花粉活力存在较大差异，AS60的花粉活力最高，有活力花粉比例高达99.231%，而AY22的花粉活力较低，有活力花粉占比78.892%。亲本花粉活力较高的杂交组合，如AY12×AY77，其F1花粉活力也较高(图2)，说明杂种F1的花粉活力与父母本的花粉活力有关。14个杂交组合F1的花粉活力均与中亲值相差不大，育性正常。

A:AY12；B：AY77； C：杂种F1。箭头指示的是无活力的花粉。

表3 14个杂交组合的花粉活力

2.3 杂种F1代同源染色体的配对统计结果

从14个杂交组合中随机选取8个杂交组合，对其F1减数分裂时期的同源染色体配对情况进行观察和统计分析，结果(表4、图3)表明，杂交组合AY12×AY77、XJ098×AY46的F1减数分裂中期染色体均为7对环状二价体，其他杂交组合的杂交F1代，减数分离期大多数同源染色体配对形成环状二价体，个别配对时形成1～2个棒状二价体。说明L1和L2谱系节节麦在染色体水平上虽有一定的遗传分化，但同源染色体同源率较高，能正常配对，产生可育的后代。

图3 杂交组合AY26×AY46的F1同源染色体配对结果图

表4 不同杂交组合中杂种F1的染色体配对情况统计结果

2.4 主要农艺性状的杂种优势分析

在定性观察的基础上，对8个F1生长势较优的杂交组合的产量(分蘖数、穗长、小穗数、粒重、籽粒结实率)、花期(抽穗期、开花期)、株型(株高、旗叶长、旗叶宽)、籽粒(颖壳长、颖壳宽、外稃长、外稃宽、内稃长、内稃宽)等相关农艺性状进行调查统计发现，L1和L2谱系的节节麦在分蘖数(表5)和粒重(表6)上表现出明显的杂种优势，而其 他性状在父母本和F1间差异不显著(数据未 列出)。

8个杂交组合的分蘖数均有良好的杂种优势，中亲优势指数(IH)为120.31%～ 223.73%，超亲优势指数(OPH)3.97%～ 86.76%。有4个组合的百粒重(表6)具有明显杂种优势，中亲优势指数(IH)在143.62%～ 147.71%，超高值亲本优势(OPH)在21.71%～28.80%。3个杂交组合(AY56×AY77、AY26×AY46和XJ47×AY46)的百粒重(IH>143%，OPH>21%)和分蘖数(IH>187%，OPH>57%)均存在明显的杂种优势。特别是AY26×AY46(图4)和XJ47×AY46(图5)在整株生长势上，杂种F1均明显优于其父母本。对上述8个杂交组合的百粒重和分蘖数进行多重比较发现(表5，表6)，杂种F1的分蘖数均显著高于亲本。

图5 杂交组合XJ47×AY46的整株表型比较图

表5 节节麦杂交组合的分蘖数杂种优势比较

表6 8个节节麦杂交组合的粒重杂种优势比较

图4 杂交组合AY26×AY46的整株表型比较图

3 讨 论

作为普通小麦D染色体的供体，节节麦是小麦育种中重要的基因资源库，节节麦与普通小麦的D基因组的染色体可发生自由交换和重组，染色体重组后几乎无负遗传作用，这些为节节麦优势基因导入普通小麦提供了便利和可行性[26]。目前已在节节麦中筛选并分离出大量抗白粉病[14-15]、小麦瘿蚊[16]、叶锈病[17]、秆绣病[18]、条锈病[19]、麦二叉蚜[20]、穗发芽[21]和耐盐、优质高分子量谷蛋白亚基[22]、耐旱[23]等有益基因，并通过普通小麦与节节麦杂交的直接转育途径，或节节麦与四倍体小麦杂交构建桥梁人工亲本六倍体小麦，再与普通小麦杂交的间接转育途径，已成功对小麦进行了遗传改良。

节节麦是小麦育种可利用的重要基因资源，世界地理分布清晰的形成了分别代表东、西节节麦分布区的L1和L2两大谱系[9-11]，中间没有过度类型，说明两个谱系节节麦在自然状态下是生殖隔离的。为揭示L1和L2谱系节节麦是否已形成遗传学意义上的生殖隔离、是否存在显著的杂交优势，本研究通过对14个L1和L2谱系节节麦及其杂交组合的花粉活力鉴定、染色体配对情况观察和16个农艺性状的统计分析发现，杂交F1的花粉育性正常，花粉母细胞在减数分裂时大多数同源染色体能正常配对形成7对环状的二价体，少数出现棒状染色体，说明L1和L2谱系节节麦间虽有明显的遗传分化，但并未产生遗传学意义上的生殖隔离。该结果与孔令让等[26]对粗山羊草与普通小麦的属间杂交研究结果类似。

对八个杂交组合的16个农艺性状调查分析表明，L1和L2谱系节节麦间在粒重和分蘖数上存在显著杂交优势，推测节节麦对提高小麦产量有重要的应用潜力。刘 磊等[27]通过对大穗、大粒节节麦AT462和强分蘖节节麦AT18杂交后代性状的相关性分析结果表明，控制节节麦穗长、小穗数、粒重等产量性状的基因间加性效应显著，可应用于小麦的产量育种。

综上可见，参与小麦进化起源的主要是L2谱系的少部分节节麦[9-10]，但存在更广泛的遗传变异、没有参与普通小麦起源的L1谱系节节麦，尤其是与L2谱系有明显杂种优势的L1谱系节节麦，是普通小麦遗传改良可利用的重要种质资源，有望通过直接或间接转育途径，用于小麦产量的遗传改良。