不同浓度奥沙利铂对胃癌细胞中p53蛋白表达及胃癌细胞增殖的影响△

国强，贾志勇，岳彦波

内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院普外科，内蒙古 包头014010

胃癌是较常见的消化道恶性肿瘤，发病率位居全部恶性肿瘤前列，发病年龄一般为50岁，但是，近年来，胃癌的发病人群正趋于年轻化[1]。胃癌的发病原因较多，发病隐匿，早期症状往往被患者误认为是消化道溃疡，且常见的计算机体层摄影（computerized tomography，CT）、血常规等检查方法较难发现，一旦发现，患者往往处于晚期，错过了手术治疗的最佳时机，给治疗带来极大困难。研究证明，胃癌细胞中的p53基因能够通过自我更新从而抑制肿瘤的复发，并调控肿瘤干细胞的分裂、肿瘤的生成，抑制相关基因在胃癌中的表达[2]。奥沙利铂为胃癌术后常见化疗药物，相关研究表明，其能够通过下调胃癌组织中p53的表达，促进胃癌细胞的凋亡[3‐5]。本研究通过提取胃癌患者胃癌组织和胃癌细胞株，并使用奥沙利铂药物作用于胃癌细胞株后，对p53蛋白的表达情况进行分析，旨在为胃癌的临床治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃腺癌细胞株BGC‐823购自中国科学院上海细胞库，奥沙利铂购自Sigma公司，1640培养基、Trizol试剂均购自美国Gibco公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，细胞凋亡‐Hoechst染色试剂盒、兔抗人p53蛋白和多克隆抗体均购自美国BD公司。

1.2 细胞增殖抑制实验

参照CCK8试剂盒说明书步骤进行检测，取处于对数生长期的细胞进行胰酶消化处理，接种于96孔板培养，24 h贴壁生长后加入含有药物的培养液进行干预，设置5个复孔，依据奥沙利铂不同浓度（0、3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）进行分组。每孔加入CCK8溶液10 μl，继续培养1.5 h，分别于奥沙利铂处理24、48、72 h时，采用Thermo FC全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度值，采用CCK8法对奥沙利铂处理24、48、72 h时的胃癌细胞的增殖抑制率进行检测。

1.3 p53蛋白检测方法及结果判定

将奥沙利铂置于37℃水浴箱中孵育15 min，去除多余奥沙利铂溶液后苏木素复染1 min，二氨基联苯胺（diaminobenzine，DAB）显色5～15 min；于显微镜下观察检测结果，分别于奥沙利铂处理24、48、72 h时，记录不同浓度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）下胃癌细胞中p53蛋白的表达情况。p53的阳性表达主要定位于胃癌细胞的细胞核内，出现棕黄色颗粒为阳性。随机选取5个高倍视野，观察并计算每个视野阳性细胞所占百分比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用重复测量方差分析；计数资料以例数表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞增殖抑制率的比较

奥沙利铂处理24、48、72 h时，随着奥沙利铂作用浓度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）的增高，胃癌细胞的增殖抑制率均逐渐增高，且同一浓度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）下的奥沙利铂处理时，随着作用时间的延长，胃癌细胞的增殖抑制率均逐渐增高。（表 1）

2.2 p53蛋白表达情况的比较

奥沙利铂处理24、48、72 h时，随着奥沙利铂作用浓度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）的增高，胃癌细胞中p53蛋白的表达水平逐渐增高，且同一浓度下的奥沙利铂处理时，随着作用时间的延长，胃癌细胞中p53蛋白的表达水平逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表1 不同浓度奥沙利铂处理后胃癌细胞增殖抑制率的比较（%，x± s）

表2 不同浓度奥沙利铂处理后胃癌细胞中 p53蛋白表达水平的比较（± s）

表2 不同浓度奥沙利铂处理后胃癌细胞中 p53蛋白表达水平的比较（± s）

注：a与0 μg/ml比较，P＜0.05；b与3.2 μg/ml比较，P＜0.05；c与6.4 μg/ml比较，P＜0.05；d与12.8 μg/ml比较，P＜0.05

浓度（μg/ml）0 3.2 6.4 12.8 25.6 F值P值24 h 10.98±1.04 8.88±1.44a 12.43±1.08a b 25.14±2.84a b c 32.45±2.43a b c d 299.464＜0.01 48 h 17.13±2.54 16.27±2.56a 22.12±2.67a b 34.26±3.45a b c 41.18±3.62a b c d 421.398＜0.01 72 h 28.33±3.56 29.67±1.76a 36.36±1.25a b 49.37±3.15a b c 52.98±3.45a b c d 487.173＜0.01

3 讨论

胃癌一般在偶然检查中发现，给患者及家属带来巨大的精神压力和经济负担。胃癌的发病原因复杂，涉及抑癌基因和致癌基因的表达及细胞生物学改变等[6]。许多研究者致力于研究胃癌的发病原因及机制，结果仍不理想，因此，尽快准确地诊断和治疗胃癌具有重要意义[7]。p53是一种重要的抑癌基因，能够通过诱导肿瘤细胞凋亡相关蛋白的激活，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡[8]。奥沙利铂是一种新型铂类化合物，对胃癌具有较好的疗效。有研究证明，奥沙利铂可通过改变p53的表达进而提高临床疗效[9‐10]。奥沙利铂在人类多种肿瘤中均表现出广谱的体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性[11]。本研究发现，奥沙利铂处理24、48、72 h时，随着奥沙利铂作用浓度的增高，胃癌细胞的增殖抑制率均逐渐增高，且同一浓度奥沙利铂处理时，随着作用时间的延长，胃癌细胞的增殖抑制率均逐渐增高，胃癌细胞中p53蛋白的表达水平逐渐增高。这说明奥沙利铂可以通过诱导p53表达，对胃癌细胞凋亡途径发挥效应，表明p53具有增强胃癌细胞对化疗的敏感性、减少不良反应、减少化疗药物剂量的作用。既往研究表明，p53基因在DNA受到损伤的情况下能够迅速激活[12]，与肿瘤患者的放化疗敏感性、转移及预后情况密切相关。

综上所述，奥沙利铂化疗能够上调p53蛋白的表达，提高胃癌细胞的增殖抑制率，且p53蛋白的表达水平和胃癌细胞的增殖抑制率与奥沙利铂的作用浓度关系密切，值得临床关注。