甲烷氧化菌合成四氢嘧啶的研究进展

王广交，辛嘉英，孙立瑞，崔添玉，许锡凯，张嘉玉

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

甲烷氧化菌是以甲烷为碳源,在液体无机盐培养基中生长的一种革兰氏阴性好氧菌。在细胞内发生代谢反应将甲烷转换为一些重要的化工产品，近年来国内外研究学者在研究创立的“甲烷生物精炼厂”，就是利用甲烷氧化菌将甲烷转化为生产生活所需的物质如胞外多糖、单细胞蛋白、聚-3-羟基丁酸(PHB)、四氢嘧啶等[1]。其中四氢嘧啶的生物合成是目前学术领域研究的热潮之一。

四氢嘧啶是氨基酸的衍生物，一种环状亚氨基酸，由于其具有手性特征[2]，化学方法难以合成无毒的四氢嘧啶，故选择生物合成的方法。其最初发现于一种光能自养型菌中，随着研究范围的扩大，在许多好氧嗜盐和耐盐的革兰氏阳性细菌中也发现有不同含量四氢嘧啶的存在[3]。自1997年以来，一些甲烷氧化菌如嗜盐甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z)，以及海洋甲基球菌属(Methylobactermarinus)和酌鄄变形菌纲(Methylohalobiuscremeensis)等已被证明在高渗透条件下可以利用甲烷氧化菌生物转化合成四氢嘧啶[4]以抵御高渗透压环境，达到保护自身细胞的目的[5]。

甲烷氧化菌使用无机盐培养，无毒条件下合成的四氢嘧啶，可以应用于食品、医药化学、化妆品等领域。甲烷氧化菌合成四氢嘧啶的途径是天冬氨酸家族氨基酸合成的一个分支，天冬氨酸首先被天冬氨酸激酶转化为β-天冬氨酸磷酸,该酶是天冬氨酸家族氨基酸(苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸)和四氢嘧啶生物合成的共同起点，通过“渗透性控制”改变天冬氨酸激酶活性使四氢嘧啶生物合成途径独立于通常控制天冬氨酸家族氨基酸合成途径的复杂控制机制，在高渗透压刺激下应激表现出高活性[6]。这条代谢途径主要通过三种酶，二氨基丁酸(DABA)氨基转移酶，DABA乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶调节代谢反应的发生最终合成四氢嘧啶[7-8]，具体代谢途径如下：首先DABA氨基转移酶(EctB)催化天冬氨酸β-半醛转氨生成L-二氨基丁酸(L-DABA)、二氨基丁酸(DABA)和乙酰辅酶A发生乙酰化反应生成Nγ-乙酰-DABA，该步反应在DABA乙酰转移酶(EctA)催化下发生，在四氢嘧啶合成酶催化下Nγ-乙酰-DABA脱水环化，最终生成四氢嘧啶。合成路径见图1。

图1 甲烷氧化菌合成四氢嘧啶的代谢途径[9]Fig.1 Metabolic pathway of ectoine synthesis by methane-oxidizing bacteria

1 四氢嘧啶的提取

由于甲烷氧化菌在细胞内合成四氢嘧啶，在正常条件下不会排放到细胞外，为了得到四氢嘧啶，供工业生产使用，研究学者使用不同的提取方法来提取菌种胞内的四氢嘧啶。提取方法分为两大类，其中一类方法使用高浓度的有机溶剂改变细胞膜通透性或使其破碎，从而溶解出胞内的四氢嘧啶，该方法具有提取率高，提取时间短等优势但会破坏细胞活性，导致细胞无法重复利用。另一类方法，通过改变盐浓度调节细胞外界渗透压，使细胞自主将四氢嘧啶排泄到细胞外，这种方法提取到的四氢嘧啶纯度高，细胞可以反复利用，但该方法提取率较低。在化工生产中可以根据不同的需要以选用不同的提取方法。近年来国内外不同学者使用以下不同的方法提取甲烷氧化菌中的四氢嘧啶。

1.1 有机溶剂法提取四氢嘧啶

Stępniewska 等[10]使用甲醇提取细胞中的四氢嘧啶。在2 000 r/min,4 ℃条件下将细胞培养液离心获得细胞，使用甲醇以1∶10(V/V)比例抽提细胞中的四氢嘧啶，然后在真空条件下除去甲醇，将干燥的提取液重新溶于水中进行活性炭吸附，用热乙醇洗脱吸附在活性炭上的四氢嘧啶，得到目标产物。最终四氢嘧啶的提取率大于90%。

兰州大学龚皎[11]使用甲醇、氯仿、水(体积比为10∶5∶4)的混合溶液来提取四氢嘧啶，取冻干后的菌种，加入甲醇、氯仿、水混合液，剧烈振荡1 h后离心，收集上清液，溶解出四氢嘧啶其中可能含有溶于混合溶液的杂质。将氯仿与水按体积比为1∶1的比例混合，向离心后的上清液中加入氯仿水混合溶液以除去其他杂质，剧烈振荡后离心，收集上清液旋干，收集产物四氢嘧啶。

华中师范大学朱德锐[12]使用乙醇抽提法提取四氢嘧啶，发酵液离心后收集菌种沉淀，加入80%的乙醇，在70 ℃下旋涡抽提30 min，离心，其沉淀重复以上步骤1次，收集2次离心后的上清液。结晶后加入与龚皎所使用不同比例的氯仿、乙醇、超纯水混合液(体积比为1∶1∶1)溶解结晶物。旋涡10 min尽可能使四氢嘧啶完全溶于混合溶液中再次离心，沉淀重复以上步骤1次，使提取更完全。收集2次离心后的上清液，再次结晶后加入体积比为2∶1的氯仿和超纯水混合液，旋涡振荡5 min除去杂质离心收集上清液，旋干，得到较纯的四氢嘧啶。

乙醇抽提的方法相对以上两种方法较复杂，但通过反复的溶解，去除不溶性杂质使得到的产物纯度较高，有利于检测。

1.2 生物挤奶技术提取四氢嘧啶

Cantera等[13]使用生物挤奶(bio-milking)技术提取甲烷氧化菌20Z中的四氢嘧啶,具体分为3个阶段：第1阶段，在甲烷氧化菌最适盐浓度下培养菌种，甲烷氧化菌快速增长提高菌种生物量；第2阶段，提高培养基的盐浓度至6%，使甲烷氧化菌在高渗条件下积累四氢嘧啶，将培养一周期的菌液离心收集菌种沉淀；第3阶段，将沉淀(菌种)溶于低盐浓度培养基中，使菌种在低盐浓度下释放四氢嘧啶至液体无机盐培养基中，离心后收集含有产物的上清液，旋干后得到目标产物。将菌体细胞重新放回新鲜的低盐培养基中继续发酵，重复6次上述“低渗-高渗-低渗”的三段发酵培养。“生物挤奶”技术提取率达70%，虽然提取率比有机溶剂法低，但该技术可以对甲烷氧化菌细胞进行反复的使用，且释放的四氢嘧啶纯度高，最重要的是该技术安全，整个工艺流程无有害物质加入，产品安全可靠。

从甲烷氧化菌中提取的四氢嘧啶经过纯化达到使用纯度后，可应用到需要领域的工业生产中。

2 四氢嘧啶的作用及应用

四氢嘧啶可减轻高渗透压、高温、冻融、脱水、辐射和化学试剂对蛋白质、核酸、生物膜的破坏，使细胞在极端环境下依然保持活性[14]。高盐环境会导致细胞渗透压升高，在这种环境条件下，渗透压变化会导致细胞内大分子物质如蛋白质变性，变性蛋白质由于高级结构变化会发生聚集和沉淀并失去活性[15]。最关键的是四氢嘧啶的存在不会对细胞的整体功能产生任何有害影响，并对细胞保持活力起到积极作用[16]。四氢嘧啶不仅可以高度保水、稳定生物分子和整个细胞功能，为大量的耐盐细菌提供渗透平衡,其亦可提高蛋白质的稳定性和保证其保持正确的折叠方式[17]。所以四氢嘧啶可以应用于多种工业化生产中细胞的保护，以提高目标产品的产量。由于四氢嘧啶为一种杂环化合物，所以具有很好的光学活性，故被应用于各种化工材料，其已经成为化工领域研究的热点。因此四氢嘧啶可以作为酶、核酸、DNA-Pro复合物[18]。由于四氢嘧啶以上多种作用，现如今四氢嘧啶在化妆品、医药化学等领域被广泛应用[19]。

2.1 四氢嘧啶在化妆品领域的应用

在美容甚至仿生领域，四氢嘧啶可被用作有效成分被添加到具有保护效果的护肤品中。由于人的皮肤无法避免长时间与外界接触，辐射、风、湿度、极端温度等外部因素会导致皮肤老化[20]。目前已经发现四氢嘧啶可以保护和稳定皮肤细胞的细胞膜，使其免受表面活性剂和导致皮肤脱水应激分子的破坏作用[21]，因此四氢嘧啶可以作为一种比甘油更有效的保湿剂，具有长期保湿效果[22]，细胞培养发现，四氢嘧啶还可以保护生物分子不变性，如保护DNA免受紫外线的损伤等[23]，因此四氢嘧啶可以用于皮肤防晒[24]，而且四氢嘧啶的抗衰老能力也已经在早些年的临床试验中得到证实[25]。Sajjad 等[26]研究发现，由于四氢嘧啶具有较强的抗肿瘤活性和氧化性，从而能有效中和细胞外辐射诱导产生的自由基，因此四氢嘧啶还可以作为潜在的辐射保护剂。

2.2 四氢嘧啶在医药化学领域的应用

在医药领域，由于四氢嘧啶是一种非常有效的淀粉酶抑制剂，所以可以用来治疗阿尔茨海默病和海绵状脑病等由于蛋白质错误折叠而形成淀粉体导致的疾病；研究表明四氢嘧啶也可以用于HIV病毒感染疾病的治疗[27]。此外，四氢嘧啶可以抑制肺病(例如肺气肿、慢性肺塞性肺病等疾病)[11]。四氢嘧啶可以通过减少细胞凋亡和氧化应激诱导的神经酰胺中介物，从而有效保护回肠粘膜和肌层。四氢嘧啶有助于特应性皮炎恢复[28]，还可以用于治疗眼睛，鼻子，皮肤干燥[29]。四氢嘧啶具有消炎作用，Dao 等[30]研究发现，四氢嘧啶可以有效减轻咽炎，在医药领域四氢嘧啶近年来被广泛应用，其经济价值约为1 000元/kg，全球消费量每年15 000 t。

3 总结与展望

四氢嘧啶在多个领域中的应用使得其成为有研究价值的化工产品之一。四氢嘧啶的开发和利用将成为一个兴起的研究领域。除甲烷氧化菌外多数嗜盐微生物也可以分泌四氢嘧啶,研究表明，有440种微生物可以自身通过代谢合成四氢嘧啶。例如，长盐单胞菌(Halomonaselongate)以葡萄糖为碳源，在NaCl浓度为12%的高盐条件下合成四氢嘧啶，并得到150.5 mg/g高产量的四氢嘧啶[31]。尽管Halomonaselongate生产四氢嘧啶的产量可能比甲烷氧化菌合成的四氢嘧啶产量高，但是该菌生产要求盐浓度较高，这样会对仪器造成严重的腐蚀，且高盐浓度使下游的分离提纯过程复杂[32]，而甲烷氧化菌在无盐条件下同样可以生产四氢嘧啶，并且以甲烷为唯一碳源产四氢嘧啶与以碳水化合物为碳源的菌相比，具有分离提纯步骤简单，环境友好等优势。甲烷氧化菌亦可以利用生物挤奶技术，通过反复调节外界环境的渗透压以刺激菌种，使四氢嘧啶被释放到细胞外，由于该技术不影响菌种的活性，菌种可以反复培养，这种培养方法具有较高的经济价值。由于四氢嘧啶在多个领域具有很高的应用价值，而化学方法难以合成，故将来可能会大量选用生物合成的方法生产四氢嘧啶。研究发现甲烷氧化菌生产四氢嘧啶具有经济价值高，方法简单等优点，适合工业批量生产，但目前在四氢嘧啶对甲烷氧化菌的保护机理以及四氢嘧啶在其他领域的作用机理方面研究成果有限[33]，在这些方面的研究会具有较大的工业价值。