桃仁承气汤治疗百草枯中毒肺损伤的实验研究∗

范兴恳 钟炳图 陈学秀 徐晓微 柳会琼 黄兆浪

（1.温州医科大学附属苍南医院，浙江 温州 325800；2.温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

百草枯（PQ）中毒以口服为主要途径，是目前急诊科最常见的中毒急危重症。人口服PQ致死量为30～40 mg/kg，病死率可达50%～70%［1］之上。本研究为了探讨桃仁承气汤对PQ中毒引起的大鼠肺损伤的保护作用及机制，应用桃仁承气汤治疗大鼠PQ中毒肺损伤模型，观察大鼠生存曲线和肺组织病理改变，检测后细胞的氧化应激状态、炎症因子水平等变化，以期为桃仁承气汤治疗PQ中毒肺损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠80只。体质量200～250 g，由温州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）2018-103。本研究动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 药物与试剂 桃仁承气汤（大黄15 g，芒硝6 g，桃仁9 g，当归9 g，白芍9 g，牡丹皮9 g，浙江宇晨中药饮片有限公司）。PQ溶液（美国先正达）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、高迁移族蛋白（HMGB1）等ELISA检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 造模与给药 实验前8 h禁食、4 h禁水。按随机数字表法分为空白对照组、桃仁承气汤对照组、PQ模型组和桃仁承气汤治疗组，每组10只。灌胃染毒给药：桃仁承气汤治疗组和PQ模型组予25%百草枯溶液灌胃染毒（100 mg/kg）；空白对照组灌胃0.9%氯化钠注射液40 mL/kg。桃仁承气汤治疗组染毒后3、9、24、48 h予桃仁承气汤灌胃（5.13 g/kg）；空白对照组和PQ模型组予等量0.9%氯化钠注射液灌胃；桃仁承气汤对照组3、9、24、48 h予桃仁承气汤灌胃。

1.4 观察大鼠一般状况及生存曲线 实验从饲养开始至实验结束，每小时观察大鼠精神状况、体表、活动、饮水进食情况，并密切观察大鼠的二便情况；每半小时观察各组大鼠死亡数，记录染毒后72 h各组死亡数，计算各组大鼠存活率。

1.5 标本采集与检测 1）血标本的检测。实验72 h后经股动脉采血，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测大鼠血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA、HMGB1的变化。2）肺干/湿重比（D/W）。采血后立即开胸取左肺精确称重，烘烤至恒重，称其干质量，计算D/W比值。3）肺组织病理学观察。取部分右肺组织，行HE染色，光镜下观察肺组织病理变化，并进行病理评分；评分项目包括水肿、充血、中性粒细胞浸润、支气管内出血和碎屑、细胞增生，每项的评分按损伤程度分为0、1、2和3分，取5项评分总和。

1.6 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，生存曲线用Log Rank Test分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状况及存活率的比较 见表1。与空白对照组大鼠比较，PQ模型组大鼠一般状况明显变差；桃仁承气汤治疗组除大便次数多、软，一般状况较PQ模型组好转。PQ模型组大鼠中毒后72 h存活率为60%，桃仁承气汤治疗组同时间点存活率为90%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。空白对照组及桃仁承气汤对照组大鼠存活率均为100%。

表1 各组大鼠存活率比较（n）

2.2 各组大鼠肺D/W和病理学指标的比较 见表2。与空白对照组比较，PQ模型组肺D/W明显下降（P<0.05）；与PQ模型组比较，桃仁承气汤治疗组肺D/W值显著下降（P<0.05）。病理组织评分：与空白对照组比较，PQ模型组大鼠肺病理组织评分明显升高（P<0.05）；与PQ模型组比较，桃仁承气汤治疗组大鼠的肺病理组织评分下降（P<0.05）。

表2 各组大鼠肺组织干湿重比和病理学评分比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织干湿重比和病理学评分比较（±s）

与空白对照组比较，∗P<0.05

组 别 肺病理学评分（分）n 肺D/W空白对照组桃仁承气汤对照组PQ模型组桃仁承气汤治疗组0.750±0.463 0.875±0.344 14.87±0.354*12.75±1.389△10 10 10 10 0.228±0.004 0.225±0.009 0.206±0.011*0.164±0.005△

2.3 各组光镜下大鼠肺组织病理学比较 见图1。光镜下空白对照组和桃仁承气汤对照组的肺脏组织结构完整，肺泡间隔无水肿、炎症，肺泡腔清晰，PQ模型组大鼠大部分肺泡腔内可见渗出、水肿、出血，肺间质有大量炎性细胞浸润，而桃仁承气汤治疗组大鼠上述病变减轻。

2.4 各组炎症因子水平比较 见表3。与空白对照组比较，PQ模型组TNF-α、IL-6水平明显升高，桃仁承气汤治疗组大鼠TNF-α、IL-6水平则较PQ模型组明显下降（P<0.05）。与空白对照组比较，PQ模型组HMGB1水平明显升高，而桃仁承气汤治疗组大鼠HMGB1水平则较PQ模型组明显下降（P<0.05）。

图1 各组光镜下大鼠肺组织病理学表现（HE染色，200倍）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比较（pg/mL，±s）

组别空白对照组桃仁承气汤对照组PQ模型组桃仁承气汤治疗组n 10 10 10 10 TNF-α 21.43±1.902 23.66±4.171 27.35±3.462*21.42±4.475△IL-6 61.56±9.469 73.12±17.82 140.3±27.46*113.2±16.39△HMGB1 14.76±1.363 17.98±2.634 33.21±6.611*25.41±7.097△

2.5 各组氧化应激因子水平比较 见表4。与空白对照组比较，PQ模型组SOD水平明显下降，MDA明显升高（P<0.05）；与PQ模型组比较，桃仁承气汤治疗组大鼠SOD水平明显升高，MDA水平明显下降（P<0.05）。

表4 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较（±s）

表4 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较（±s）

组别空白对照组桃仁承气汤对照组PQ模型组桃仁承气汤治疗组n 10 10 10 10 SOD（ng/mL）1.200±0.0088 1.324±0.1594 0.667±0.1819*1.233±0.3307△MDA（nmol/mL）0.3973±0.0784 0.4321±0.1423 0.6677±0.1598*0.3612±0.1682△

3 讨 论

PQ致死率高，发病机制复杂，救治困难。目前临床上对PQ中毒导致的损伤治疗并无特异的治疗药物［2-3］。本团队研究一系列在实验动物体内能降低PQ中毒的药物如：Betanin［4］、二巯丙磺钠［5］、血必净注射液［6］、乌司他丁［7］等，这些药物大多减轻动物体内氧化损伤、降低炎症因子水平，可改善受损脏器的功能，但临床上效果不理想。因此，寻找能提高PQ急性中毒解毒疗效药物，降低死亡率具有重大的意义。中医药治疗PQ中毒肺损伤方面的文献记载较少，尤其是经方。桃仁承气汤见载于《温病条辨》。《温病条辨·下焦篇》第21条云“少腹坚满，小便自利，夜热早凉，大便闭，脉沉实者，蓄血也。桃仁承气汤主之”。本方由大黄、芒硝、桃仁、当归、白芍、牡丹皮组成，功擅泻热通腑，活血化瘀。有文献报道，桃仁承气汤能升高ALI/ARDS大鼠SOD水平，降低TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）等水平，并且减轻肺间质及肺泡炎性细胞的浸润、渗出和积聚，改善肺水肿与肺瘀血，有一定的肺保护作用［8-9］。

PQ致肺损伤在临床上主要表现为咳嗽、喘憋、胸闷、呼吸频率加快（气促），甚至口唇发绀，多伴有肠鸣音减弱、腹胀便秘等。其基本的病理特点在于肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损，血管通透性增强引起肺间质和肺泡水肿，肺内开放的血管减少形成微血栓，导致肺内微循环障碍。中医文献中虽无此类病的记载，但根据其临床所表现的呼吸窘迫、口唇发绀、腹部胀满、大便秘结等特点，可将之归于“暴喘”“喘脱”和“腑实”“结胸”等范畴［10］，晚期属于“肺痿”范畴。早期本病病机多属邪毒内滞肠胃，肺失宣降，肺气上逆，气滞血瘀；晚期本病病机多属肺叶瘘废，肾不纳气［11］。针对PQ肺损伤的病因及临床表现，中医学认为邪毒从口而入，虽经洗胃，但仍有PQ潴留胃肠，热毒壅滞，肺与肠相表里，肠病及肺，肺肠同病，故中医学从整体观念的理论出发，认为“肺与大肠相表里”是PQ肺损伤发病机制之一或密切相关。“肺与大肠相表里”理论早已在中医学记载，现代学者对其理论内涵和临床应用已有许多方面的研究，成果颇丰。现代研究认为肺与大肠在生理、病理信息表达上存在共振现象：信息通路传导、微生物菌群协调、相同黏膜免疫机制、特殊分子表达、胚胎早期同源性。肺与大肠相表里理论临床应用广泛，主要是肠病治肺、肺病治肠、肺肠同治等。但在PQ中毒肺损伤中的应用目前未见文献报道。笔者在“肺与大肠相表里”理论指导下，应用桃仁承气汤使PQ泻下而逐瘀，通腑气以利肺气，利肺气以助血行，从而发挥肺主治节的功能［12］，待进一步验证。

在本实验中，我们制作了大鼠PQ灌胃中毒急性肺损伤模型，探讨了桃仁承气汤对PQ中毒引起的大鼠肺损伤的保护作用及机制，分别在分子及蛋白水平、病理学等检测了炎症因子、氧化应激等相关指标，结果显示：桃仁承气汤对PQ染毒大鼠肺的炎症反应因子、氧化应激水平有影响；对肺组织病理学改变方面有影响；桃仁承气汤对中毒大鼠一般状况、生存时间有影响。从本实验结果具体分析如下：与PQ模型组比较，桃仁承气汤治疗组HMGB1水平及MDA含量相对降低，SOD活力相对升高，IL-6及TNF-α的水平也相对降低。从光镜下和病理学评分可以看出，桃仁承气汤能明显改善PQ对肺组织的病理损伤；生存时间、生存率较PQ组明显提高，可以推论桃仁承气汤能延长PQ中毒急性肺损伤大鼠的生存时间。在抗氧化应激的方面，桃仁承气汤能抑制MDA的活性，提高SOD的活性，从而发挥了抗氧化应激作用；炎症因子水平检测结果提示桃仁承气汤能抑制IL-6、TNF-α、HMGB1等炎症因子的释放。姚永明等［13］认为HMGB1可分泌到细胞外，可与TNF-α、IL-6等重要炎症因子相互诱生。循环HMGB1在脓毒症后期升高，有可能作为一种晚期炎症介质参与脓毒症的发生与发展过程［14］。HMGB1被认为既是炎症早期的启动者，又是炎症晚期的促进者［15］。炎症反应、氧化应激、细胞凋亡与自噬等都可能参与到ALI的发生发展过程中，而这些病理变化之间又有千丝万缕的关系，相互交错，构成复杂性网络，共同作用［16-17］。桃仁承气汤的泻下逐瘀、通腑利肺、肺主治节功效主治原则在PQ中毒大鼠肺损伤炎症反应调控和信号通路机制中有体现［18-20］。总之，桃仁承气汤可能通过抑制HMGB1及其与IL-6、TNF-α等炎症因子相互诱生和通过抑制MDA、提高SOD活力从而实现对PQ中毒大鼠急性肺损伤的保护作用。