瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表达及与转化生长因子-β1的相关性

林简 刘晓红 王荣坤 李涛 李娜 陈惠娟

[摘要]目的：检测瘢痕疙瘩中微小RNA-34b（miR-34b）的表达，分析其与转化生长因子-β1（TGF-β1）的相关性。方法：收集42例瘢痕疙瘩术后组织作为观察组，收集42例增生性瘢痕术后组织作为对照组，收集正常皮肤组织42例作为正常对照组。应用实时荧光定量PCR法检测三组中miR-34b的表达，应用免疫组化和Western Blot法检测观察组中TGF-β1的表达。结果：观察组中miR-34b的表达明显低于对照组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组中miR-34b的表达在有无家族史及不同病变高度的分组中差异有统计学意义（P<0.05）;而在不同性别、年龄、病程的分组中差异无统计学意义（P>0.05）。相关分析显示miR-34b与TGF-β1呈负相关性。结论：瘢痕疙瘩中miR-34b低表达，与家族史及病变增生的高度相关。miR-34b与TGF-β1具有协同负向作用。

[关键词]瘢痕疙瘩;miR-34b;转化生长因子-β1;相关性;增生性瘢痕

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）07-0093-03

Abstract： Objective  To detect the expression of microRNA-34b （miR-34b） in keloid， analyze its correlation with transforming growth factor-β1（TGF-β1）. Methods  42 cases of keloid were collected as the observation group. 42 cases of hypertrophic scar were collected as the control group. 42 cases of normal skin were collected as the normal control group. The expression of miR-34b was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and TGF-β1 was detected by immunohistochemistry and Western Blot method. Results  Expression of miR-34b was significantly lower in the observation group than that in the control group and the normal control group， the difference is statistically significant（P<0.05）. The expression of miR-34b was statistically significant in family history and different lesion hight（P<0.05）， but there was no significant difference in gender， age and course of disease（P>0.05）. Correlation analysis showed that miR-34b was negatively correlated with TGF-β1. Conclusion  Lower expression of miR-34b is related to family history and lesion height. MiR-34b and TGF-β1 have synergistic negative effects.

Key words： keloid; miR-34b; TGF-β1; correlation; hypertrophic scar

瘢痕疙瘩是皮膚创伤愈合过程中形成的病变，主要为成纤维细胞异常增殖、胶原过量沉积引起的纤维组织过度增生[1]。临床上因瘢痕挛缩引起的功能异常也较为常见。目前瘢痕疙瘩发生的分子生物学机制不明确。有研究显示高表达的转化生长因子-β1（TGF-β1）具有促进成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的作用，其常通过SMAD、MAPK和PI3K等通路发挥作用[2]。近年来有学者关注到微小RNA（miRNA）可能与病理性瘢痕的形成有关。miRNA是一种非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核动物体内，与其他基因的非编码区域互补，在转录和翻译水平上调控基因的表达[3]。借鉴肿瘤学中的筛选方法，选择与侵袭相关的miR-34b进行研究，并应用TargetScan和RNA22数据库预测到TGF-β1可能是miR-34b的靶因子。基于此，本实验进行前瞻性研究，观察miR-34b在瘢痕疙瘩中的表达意义，分析其与TGF-β1的相关性，以期为研究病理性瘢痕的发生发展提供帮助。

1  资料和方法

1.1 临床资料：选择笔者医院2018年1月-2019年6月确诊为瘢痕疙瘩并行手术治疗的患者42例作为观察组。纳入标准：①肿块隆起于皮肤表面，质硬，表面光滑发亮，界限欠规则，1年内无自然消退迹象;②病变超出原始损伤边缘，向周围正常组织发生浸润，蟹足状生长;③具有持续性生长、发红、痛痒等症状，无自愈倾向，不能自行消退;④病理学证实瘢痕组织内有胶原及基质成分的大量沉积，成纤维细胞很多，并有分裂像。其中男22例，女20例，年龄18～36岁，平均为（24.0±4.9）岁。选择同期在笔者医院确诊为增生性瘢痕并行手术治疗的患者42例作为对照组。纳入标准：损伤因素明确、瘢痕色泽红、质硬，高出皮肤，瘢痕的增殖不超过损伤范围。其中男20例，女22例，年龄19～42岁，平均为（26.7±4.2）岁。选择同期因体表皮下良性肿物切除术时切取的正常皮肤组织42例作为正常对照组，其中男21例，女21例，年龄18～36岁，平均为（23.9±4.0）岁。均留取术后的新鲜组织（-80℃冻存）及石蜡包埋组织。三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签定知情同意书。

1.2 样本量评估：应用两样本均数比较的评估方法：即n1=n2=2[（uα+uβ）/δ/σ]2+1/4uα2，按预实验中miR-34b的表达并查阅文献，拟正常皮肤组织中的表达量为2.2，瘢痕疙瘩中的表达量为1.1，二者的差值是1.1，如果σ=1.1，δ/σ=0.9，α=0.05，计算n1=n2≈42例。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR实验：应用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测miR-34b的表达，检测基于新鲜标本。miR-34b引物上游：5'-ATCGGCCCAAAGTGGTG-3'，下游：5'-ACAAACTGGACTCAGCTT-3'。以U6为内参，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。引物由苏州睿赢生物技术公司合成。严格按说明书进行操作。反应程序：95℃ 5min，1个循环;95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15个循环;93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s。共40个循环。60℃时采集信号，记录Ct值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因（未知样品）-CtGAPDH（未知样品）]-[Ct目的基因（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）]。

1.3.2 免疫组化实验：瘢痕疙瘩中TGF-β1的表達应用免疫组化SP法。试剂购自武汉博士德生物技术公司。常规取材、脱水、石蜡包埋后，切取4μm切片。先进行预实验，选择TGF-β1为1：150的浓度用于正式实验，行DAB显色。严格按实验步骤操作，做好质控工作。结果由病理医师应用盲法评定。TGF-β1的阳性部位是细胞质，以浅黄到棕褐色定为阳性。着色强度：以无、浅黄、黄、棕褐色分别计为0分、1分、2分、3分、4分。随机选择3个400倍视野进行计数，取阳性率的平均值，以阳性率<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别计为0分、1分、2分、3分、4分，两者相加为最终评分，总分0～7分。以≥3分为阳性，以<3分为阴性，计算阳性率。

1.3.3 Western Blot实验：瘢痕疙瘩中TGF-β1的半定量表达应用Western Blot检测。严格按实验步骤进行蛋白提取、蛋白浓度测定、蛋白变性、加样、电泳、电转膜、免疫杂交后，取出膜后加入超敏发光液，发光时间3min。X胶片盒曝光2min，显影25s。应用Image J分析，以TGF-β1与GAPDH的比值作为相对表达量。

1.4 统计学分析：应用SAS 6.12软件进行分析，率的比较应用卡方检验，定量资料应用均数±标准差表示，两组间比较应用t检验，多组间比较应用方差分析（SNK法行两两比较），应用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 三组中miR-34b表达比较：观察组中miR-34b的表达明显低于对照组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，见图1～2。

2.2 观察组不同临床特征中miR-34b表达比较：观察组中miR-34b的表达在有无家族史及不同病变高度的分组中差异有统计学意义（P<0.05）。而在不同性别、年龄及病程的分组中差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 miR-34b与TGF-β1的相关性：免疫组化检测瘢痕疙瘩中TGF-β1表达的评分为0～7分，相关分析显示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有负相关性（r=-0.53，P=0.018）。见图3～4。Western Blot检测瘢痕疙瘩中TGF-β1的表达范围是1.2～8.1，相关分析显示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有负相关性（r=-0.49，P=0.026）。见图5～6。

3  讨论

miRNA在细胞内广泛存在，是一类长度为22bp的内源性非编码RNA，其能对染色体和遗传因素进行有效的调控，对发育的间质细胞进行调控[4-5]。miRNA是重要的转录后调节因子[6]。miR-34b与肿瘤的侵袭性生长有关，有研究认为瘢痕疙瘩为结缔组织肿瘤，具有向周围正常组织浸润的作用[7-8]，因此本实验在选择miRNA因子时参考病变具有的侵袭性生长的生物学行为，亦参考了TCGA数据库，筛选到miR-34b可能是与间质异常增殖和间质细胞侵袭生长相关的因子。有研究认为前miR-34b具有茎环结构，经过细胞核及细胞浆内的处理成为成熟的miR-34b[9]。成熟的miR-34b长度约为21～22个核苷酸，有6～7个相同的核苷酸种子序列，种子序列为miRNA与靶mRNA结合的绑定单位，通过与mRNA 3-UTR的互补进而调节下游因子，发挥生物学作用[10]。MiR-34b的靶基因较多，主要是与间质细胞形成相关的因子，如TGF-β1、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和Ⅳ型胶原等[11]。TGF-β1是目前认为与瘢痕形成相关的重要因子，其高表达对促进纤维母细胞增殖，刺激胶原的合成，诱导纤维连接蛋白的产生有重要作用[12]。研究显示TGF-β1更多是受基因调控发挥生物学作用的[13]。

本研究结果显示瘢痕疙瘩中miR-34b的表达明显下降，提示miR-34b异常表达是病变形成的重要促进因子。本研究发现miR-34b与TGF-β1呈负相关性，且经免疫组化结果和Western Blot结果证实，提示二者具有明确的负向协同作用。TGF-β1是一种分泌型活性多肽，在瘢痕疙瘩的发病过程中发挥着重要的促进作用，尤其是对成纤维细胞的增生，细胞外基质中胶原、蛋白多糖、糖蛋白等过量沉积有明显作用，胶原纤维排列紊乱也是TGF-β1调节的结果。TGF-β1高表达时可以引起MMP-9表达的下调，对基质的降解作用减弱，细胞外基质和IV型胶原的合成增高[14]。TGF-β1可能是miR-34b下游的靶基因，但是本研究尚不足以证实miR-34b与TGF-β1的靶向关系，后续研究应进行瘢痕细胞系的构建，应用双荧光素酶报告基因实验等证实二者的关系。本研究显示miR-34b的表达在有无家族史及不同病变高度的分组中差别有统计学意义，提示miR-34b低表达预示着遗传倾向及较高的增殖特征，也预示着较高的复发风险。miR-34b低表达引起纤维细胞繁殖加快，对局部组织的浸润和侵袭增多。miR-34b可能是促进上皮间质转化的重要因子[15]。生物信息学显示miR-34b与MMP-9的3'非翻译区有一个保守的结合位点，推测MMP-9可能是miR-34b的靶基因，miR-34b在瘢痕中的作用可能与MMP-9有关，这与本研究的结论相仿，主要是TGF-β1可以调控MMP-9在胶原形成中的表达。miR-34b的正常表达状态是维持上皮和间质形态的重要因子。研究中未发现miR-34b的表达与病程的关系，这显示出miR-34b低表达状态对瘢痕形成可能不具有持续性的作用。miR-34b可能具有瘢痕形成中转录调节因子的作用，使纤维细胞的凋亡受到抑制，增殖程度改变[16]。但是我笔者推测miR-34b在调节间充质的干细胞多向分化中的作用不大。

总之，瘢痕疙瘩中miR-34b低表达，与家族史及病变增生的高度相关。miR-34b与TGF-β1具有协同负向作用。

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[收稿日期]2019-12-10

本文引用格式：林简，刘晓红，王荣坤，等.瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表达及与转化生长因子-β1的相关性[J].中国美容医学，2020，29（7）：93-96.