围产期孕妇B群链球菌三种筛查方法的评估

张昭勇，杨宏伟，张吉才

B群链球菌(group B streptococcus, GBS)又名无乳链球菌，是一种共生的革兰阳性细菌，常定植于人体的直肠和泌尿生殖道。围产期孕妇生殖道或直肠定植的GBS可以在分娩期间垂直传播，常引起新生儿GBS感染。据报道，全世界大约18%的孕妇发生阴道直肠GBS定植，不同地区定植率从13%～35%不等[1]。国内报道围产期孕妇GBS定植率约9.06%，提示准确检测GBS至关重要，因为产时抗生素的使用可以显著减少新生儿GBS感染[2]。

围产期孕妇GBS筛查正受到全世界的高度重视，2010年美国疾病预防控制中心(centers for disease control and prevention，CDC)修订了“预防围产期B组链球菌疾病指南”，建议对35～37周围产期孕妇进行GBS定植筛查[3]，我国“孕前和孕期保健指南(2011年)”也对此筛查进行了推荐。目前GBS筛查方法包括细菌培养、免疫层析和分子生物学等。虽然传统细菌培养法具有敏感性高、特异性强的特点，但是耗时耗力，专业技术要求高；免疫层析法操作方便简单，半小时内可以出结果，但是敏感性和特异性存在不足[4]。Xpert GBS LB系统是一种全新的快速检测GBS的全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链式反应系统，可以在2 h内快速对样本进行核酸提取、纯化及浓缩检测。该系统可直接检测标本，也可对增菌或分离后的标本进行检测，有报道称其敏感性较显色肉汤增菌培养法提高10%～15%[5]。为了对上述GBS筛查方法进行合理评估，笔者对1063份围产期孕妇生殖道或直肠标本进行同时检测，以显色肉汤增菌培养法作为GBS筛查的“金标准”，对Xpert GBS LB法、免疫层析法和普通培养法进行诊断效能评价。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2019年4—6月湖北医药学院附属医院产科门诊行GBS筛查围产期孕妇(35～37周)1063例,年龄21～43(26.8±12.98)岁。

1.2仪器与试剂 美国赛沛GeneXpert Dx System及Xpert GBS LB试剂盒，DL-GBS 96培养分析系统及链球菌选择性显色肉汤培养基(珠海迪尔生物有限公司提供)，哥伦比亚血琼脂平板，DL-96细菌鉴定系统及鉴定板，GBS胶体金快速检测试剂盒购自广州辉康生物科技有限公司。

1.3标本采集及检测方法

1.3.1标本采集：由产科医师采集孕35～37周孕妇阴道(897例)或直肠(166例)拭子标本于运输培养基中立即送检。

1.3.2Xpert GBS LB检测：取采集标本棉签于样本处理液中充分混匀，震荡后室温孵育15 min，取2 ml上清液加入检测试剂盒并加载到GeneXpert Dx System，大约2 h内自动完成GBS检测。

1.3.3GBS普通培养及显色肉汤增菌培养：GBS普通培养：取采集标本棉签接种哥伦比亚血琼脂平板，35℃、5% CO2孵育18～24 h后，挑取可疑菌落革兰染色阳性、触酶阴性初步鉴定后，进行CAMP试验和DL-96细菌检测系统鉴定。GBS显色肉汤增菌培养：取GBS选择性显色培养基置室温平衡，将稀释液倒入冻干粉中，混匀溶解，将采集的标本拭子插入培养瓶充分洗脱标本，然后加封1.5 ml矿物油，旋紧盖子，放置DL-GBS 96培养分析系统，8～48 h自动报告结果。

1.3.4GBS免疫层析法检测：取1、2号抽提液各5滴，混匀；将采集标本棉签插入充分洗脱标本，取出3滴混合洗脱液，加入样品孔内；放置8～10 min后读取结果。阳性为在质控区与测试区同时出现红线；阴性：质控区出现红线，测试区不出现红线；无效：质控区不出现红线。

1.4统计学方法

1.4.1样本含量估算：估计该试验敏感度为85%，特异性为80%，设允许误差Δ=0.10，α=0.05，Zα=1.96(双侧)。则病例组样本量=1.962×0.90×(1-0.90)/0.102=49；对照组样本量=1.962×0.80×(1-0.80)/0.102=92，研究样本多于最少估计例数，具有研究意义。

1.4.2一致性检验：Kappa一致性检验评价不同检测方法的一致性，当κ<0表示一致性强度极差，当κ为0～0.20时表示一致性强度微弱，当κ为0.21～0.40时表示一致性强度弱，当κ为0.41～0.60时表示一致性强度中度，当κ为0.61～0.80时表示一致性强度高度，当κ为0.81～1.00时表示一致性强度极强。Kappa值的假设检验，U>1.96、P<0.05可认为两种测定方法结果具有一致性[6]。

1.4.3诊断试验评价：以显色肉汤增菌培养法为“金标准”，计算3种筛查方法的敏感性、特异性、阴/阳性预测值等性能指标。χ2检验比较不同方法的阳性检出率，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.13种GBS筛查方法检测结果及一致性比较 与显色肉汤增菌培养法比较，Xpert GBS LB法和普通培养法具有极强的一致性，免疫层析法仅具有中度一致性，见表1。

表1 3种GBS筛查方法检测结果及一致性比较

2.2不同GBS筛查方法阳性检出率比较 与“金标准”显色肉汤增菌培养法比较，Xpert GBS LB和免疫层析法检出率差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，普通培养法检出率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同GBS筛查方法阳性检出率比较

2.33种GBS筛查方法诊断效能评价 3种筛选方法中，普通培养法特异性最高，Xpert GBS LB敏感性最高，而免疫层析法的敏感性和特异性均较差，见表3。

表3 3种GBS筛查方法诊断效能评价

3 讨论

20世纪70年代，GBS感染成为美国新生儿发病率和病死率升高的主要原因，最初报告显示病死率高达50%。母亲泌尿生殖道或胃肠道中GBS定植是该类疾病的主要危险因素，一项经典的前瞻性队列研究表明，GBS生殖道定植的孕妇较GBS培养阴性孕妇发生新生儿GBS感染的可能性高25倍以上[7]。因此，围产期孕妇GBS筛查和产前抗生素的预防成为降低新生儿GBS感染率和病死率的重要措施[8-9]。自2002年美国CDC指南发布以来，细菌培养已成为围产期孕妇GBS筛查的“金标准”。由于传统培养法敏感性较低，2010年美国CDC指南将显色肉汤增菌培养法推荐为GBS定植筛查的“金标准”。虽然基于培养的GBS筛查极大降低了新生儿GBS感染相关疾病的发病率和病死率，但是培养法对人员素质的高要求和速度较慢的特点已无法满足临床快速筛查的需求[10]。鉴于传统培养法的固有缺点，临床亟需一种快速、灵敏、高特异性的新型筛查方法。目前针对GBS快速筛查方法主要包括免疫层析法和Xpert GBS LB法，对这些新型方法筛查效能进行合理评估有利于临床做出合理选择。

Xpert GBS LB系统是一种全新的快速检测GBS的全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链式反应系统，主要通过检测GBS cfb基因区域从而对细菌进行鉴定。该系统可以在2 h内快速对样本进行核酸提取、纯化及浓缩检测。Xpert GBS LB法可直接检测标本，也可对增菌或分离后的标本进行检测，试验的检测极限报告为131 cfu/ml。GBS普通培养法检测极限为10～100 cfu/ml，但在本研究中其敏感性低于Xpert GBS LB法。Xpert GBS LB法较高敏感性的原因包括：通过检测死亡细菌细胞中的残留DNA而得到增强，而培养标本未能及时处理和可能导致部分活菌死亡使得培养敏感性下降；鉴定了培养物中遗漏的非β-溶血性GBS。Xpert GBS LB法可出现假阴性结果，其原因可能是GBS cfb基因区域染色体缺失所致[11-12]。本研究中Xpert GBS LB法高敏感性证明了使用分子方法检测GBS可有效提高围产期孕妇携带者的检出率，从而可能进一步降低早发性GBS感染的发生率。

GBS免疫层析法是通过标记的单克隆抗体与GBS抗原特异性结合形成抗原抗体复合物,而被固相多克隆抗体捕捉呈现红色色带即阳性。临床分离的GBS特异性荚膜多糖类型繁多，已知的血清型多达十余种，即Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ型。因此，使用荚膜多糖作为抗原靶标可能使情况变得十分复杂，与GBS亲缘关系较近的A群、草绿色链球菌均可能导致假阳性的产生[13-14]。本研究中免疫层析法虽然阳性检出率为24.55%，但是其中10.15%为假阳性结果，主要原因是生殖道或肠道正常菌群复杂引起的交叉反应导致。在3种检测方法中，免疫层析法的一致性最差，这提示我们对该方法需要寻找更加特异的抗原抗体。虽然免疫层析法的敏感性和特异性均存在一定的不足，但是该法简便易操作，对检验人员要求低，可以在比较简单的实验室开展，因此是基层医院可行的一种方法。

普通培养法既往长期作为GBS筛查的“金标准”，敏感性过低是其主要缺点。在我们的研究中也发现普通培养法的阳性检出率最低。普通培养法的另外一个缺点是操作烦琐，需24 h或更长时间才能获得培养结果，并且需要专业的微生物人员才能完成[15]。当孕妇携带的病原菌负荷比较低或接种标本量不足可导致假阴性结果的出现。其次，临床约5%的非β-溶血性GBS可能被检验人员认为是草绿色链球菌丢弃而漏诊。但是，普通培养法与显色肉汤增菌培养法一致性及诊断特异性高为临床所认可，特别是能够为临床提供完善的药物敏感性结果，并且可以监测定植菌株的耐药变迁，因此是临床不可或缺的重要环节[16]。

总之，临床常用的3种GBS筛查方法，与临床“金标准”显色肉汤增菌培养法比较，Xpert GBS LB法和普通培养法具有很高的一致性，免疫层析法仅具有中度一致性。3种方法各有优劣点，免疫层析法操作简单易行，适合于基层医疗机构开展；普通培养法特异性高，可以为临床提供全面的筛查和药物敏感性结果；Xpert GBS LB法在检测效能上优于免疫层析法和普通培养法，可有效提高围产期孕妇GBS感染检出率，降低早发性GBS感染发生率。