与心肌缺血再灌注损伤相关的新型心肌保护分子靶点研究进展

侯凯,李运曼

(中国药科大学生理教研室,江苏 南京 210009)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是全世界人口死亡和致残的主要原因。在全世界临床研究中，ST段抬高或非ST段心电图诊断的AMI案例尤为常见，每年首次发作和复发性发作的案例数量惊人。及时采用溶栓治疗或直接经皮冠状动脉以及外科冠状动脉搭桥术介入治疗进行冠脉血运重建是减轻AMI损伤并限制心肌梗死最有效的早期治疗方法[1]。然而，虽然心肌完成再灌注，但这个过程本身通过多种病理生理机制引起心肌细胞的进一步死亡，从而触发心肌再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。

1 MIRI简介

MIRI是病理性缺血与梗死心肌治疗后再损伤的耦合性疾病，尤其难以治疗[2]。活性氧和氮(reactive oxygen/nitrogen species，ROS/RNS)的生成增多， NO的可用性降低，Ca2+超载，线粒体通透性过渡孔(mitochondrial permeablity transition pore, mPTP)的开放造成了MIRI。因此研究关键分子靶点动态调节机制，以及在心脏保护背景下的逆转条件是至关重要的。除了抗氧化酶, 一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)及其他新型分子靶点如线粒体靶向H2S供体AP39及其辅助靶点最近被确定为H2S合成的关键参与者，它以一种独立于经典胞质信号传导机制的方式调节心肌细胞存活。此外，随着心肌细胞分离培养技术的不断发展，MIRI模型被建立、心肌梗死面积被多维定量、体内外心肌细胞功能评价方法也得到改进[3]。新的心脏保护基因和蛋白的亚细胞定位及其机制被越来越多地发现[4]。

为了理解动物实验阳性结果与临床数据不一致之间的冲突，有必要关注导致MIRI的细胞机制，以确定更精准的新型心脏保护靶点。AMI后MIRI的典型表征为线粒体变形和破裂[5]、氧化还原呼吸链的功能丧失[6]、微血管炎症[7]和免疫应答反应[8]。心肌线粒体的损伤会导致早期再灌注期间线粒体代谢紊乱，因此许多AMI患者尽管成功地进行了再灌注治疗，但是仍伴随严重的心肌损伤甚至心力衰竭。因此，除了传统的治疗方案外，还需要例如基因组学、表观遗传学和蛋白质组学提供更有效策略，针对新型分子靶点进行有效的心脏保护，以限制MIRI并保护AMI后的心功能，防止心力衰竭的发生，从而提高患者的存活率。

综上，主要从分子药理水平和MIRI的潜在治疗意义出发，对几种新型心肌梗死驱动和拮抗靶点药物进行简要概括。

2 MIRI的线粒体因子

2.1 抑制氧化应激对心脏的保护作用

MIRI过程中心肌细胞线粒体的破坏是由于维持氧化和还原应激之间稳态的控制器功能异常引起的，这是细胞适应内源性或外源性有害刺激所经历的典型双动态阶段[5, 9]。相反，氧化应激期间的不适应在MIRI的病理生理中起关键作用。用H2S处理MIRI大鼠表明，原纤维间线粒体(intermyocardial fiber mitochondria，IFM)在减轻MIRI的心脏保护中起着重要作用[10]。探索线粒体特异性H2S供体AP39对MIRI的保护作用，使用复合物I(谷氨酸和苹果酸)和复合物II(琥珀酸，在鱼藤酮存在情况下能抑制复合物I)的底物在两种IFM中表明，AP39可以通过亲环蛋白D依赖性机制抑制线粒体ROS的产生和mPTP的开放，而不会影响线粒体的呼吸。ROS引起MIRI损伤的一个主要来源可能是琥珀酸盐驱动下通过复合物I的反向电子传输。

MIRI时H2O2的产生可能与苹果酸脱氢酶产生的Mg2+依赖的NADH有关，实验显示它可被标桩菌素阻断，这表明其起源于复合物III；而能够被匹利定抑制，证明了NADH相关的泛醌在ROS降低中的重要性[11]。在心肌缺血期间，厌氧代谢主要是由于能量衰竭，从而降低了细胞内的pH值。Na+/H+交换泵随后排出过量的H+，以缓冲H+的累积，这会导致大量的Na+和Ca2+流入。心肌细胞中Ca2+超载伴随着细胞内蛋白酶的活化，从而破坏了肌原纤维，并诱导了过度收缩和挛缩带坏死。从啮齿动物模型到人类患者的最新研究报告显示，受损心肌在MIRI期间琥珀酸的释放与缺血程度有关[12]。柠檬酸循环琥珀酸酯在再灌注过程中的选择性累积是缺血时普遍的代谢特征，并作为MIRI早期的关键驱动力助力于线粒体ROS的产生。再灌注后，累积的琥珀酸很快被琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)再氧化，通过线粒体复合体I上的反向电子传输产生大量的ROS。基于这种ROS产生的新途径，可以将缺血时琥珀酸盐积累的减少或SDH的抑制作为MIRI的潜在治疗靶标。

2.2 线粒体心脏保护蛋白对心脏的保护作用

基于线粒体通透性转变的发生可能是MIRI主要机制的假设，最近Paradis等[13]对线粒体转位蛋白(translocator proteins, TSPO)在心脏保护中的作用进行了研究。TSPO是一种高亲和力的胆固醇结合蛋白，参与mPTP的形成，并与凋亡、增殖、分化和线粒体功能的调节等细胞的关键功能相关。值得注意的是，TSPO配体蛋白 4′-氯地西泮通过抑制再灌注过程中胆固醇和氧甾酮的蓄积来保护线粒体功能以此预防MIRI，这表明抑制胆固醇蓄积可能是一种有效的治疗策略[14]。除了破坏蛋白质和脂质外，MIRI期间产生的ROS还引起DNA氧化损伤，诱导DNA链断裂，核碱基单加合物和DNA-蛋白质交联键形成，从而引发DNA断裂和心肌细胞死亡。例如，新型的线粒体DNA修复融合蛋白Exscien1-III可以减弱MIRI期间的适应不良重塑[14]。

超过60%的线粒体蛋白质包含参与能量调节的乙酰化位点，例如抑制线粒体代谢和ATP合成，这在MIRI过程中至关重要。这种类型线粒体蛋白的翻译后修饰(post-translational modification, PTM)主要由位于线粒体中的3个SIRT家族成员调控。SIRT3和SIRT5在针对MIRI的心脏保护中的上游作用表明线粒体靶标具有MIRI的潜在治疗作用。具体来说，通过研究MIRI的遗传啮齿动物模型，发现缺失SIRT3的心脏缺血后恢复率降低，且线粒体ROS的产生和线粒体蛋白的氧化增加[15]。

进一步的遗传学研究已将SIRT3鉴定为通过AMPK-Drp1途径能够稳定线粒体裂变的抗MIRI心脏保护新介质。同样，SIRT5被认为是通过激活相关的细胞因子底物阻止级联损伤的关键因子。细胞色素C(cytochrome c，Cyt-c)是一种极其重要的小型血红蛋白，可将电子从Cyt-c还原酶转移到线粒体内膜和外膜之间的半胱氨酸氧化酶上[16]。除乙酰化外，线粒体电子传输链(electron transport chain, ETC)与MIRI相关的几种关键蛋白翻译后修饰，包括磷酸化、甲基化、硝化、亚硝基化和亚砜化，也被认为是潜在的心脏保护靶标[17]。

2.3 激活线粒体自噬和抑制线粒体裂变对心脏的保护作用

MIRI通常作为对原发性缺血损伤的适应性反应而启动，并预期组织可以满足对氧气的增加需求。由于心脏是高度氧化的器官，线粒体裂变在MIRI的发展中起着积极的作用，而线粒体动态变化的另一个关键功能是通过线粒体自噬，选择性清除受损和功能异常的线粒体，从而对心脏成纤维细胞和血管平滑肌细胞产生影响[18]。

在生理条件下，局部缺血激活哺乳动物线粒体受体蛋白FUNDC1结构域，该结构域包含微管相关蛋白1轻链3α(protein 1 light chain 3 Alpha，LC3)片段，该受体通过与LC3相互作用来介导缺氧和线粒体应激引起的线粒体自噬，选择性去除受损的线粒体并限制Cyt-c积液，从而抑制心肌细胞凋亡。因此，FUNDC1在常氧条件下被SRC激酶和CSNK2/CK2磷酸化，而在缺氧条件下被PGAM5或其他磷酸酶去磷酸化，从而增强FUNDC1-LC3的相互作用[19]。在MIRI期间，与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3，RIPK3)和蛋白激酶CK2α的增加会使FUNDC1的抗凋亡作用失活，并随后降低心肌细胞的线粒体吞噬能力，从而导致更严重的心肌梗死和微血管功能障碍。更多与线粒体裂变或线粒体自噬直接相关的抗MIRI靶点通过功能丧失实验和功能获得性研究被发现，其中包括线粒体分裂蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)、双特异性蛋白磷酸酶1(dual-specificity protein phosphatase 1，DUSP1)、Bax抑制剂1(baxinhibitor 1，BI1)和褪黑素等(表1)。

表1 与MIRI有关的线粒体靶点

3 MIRI过程中的免疫应答反应

3.1 MIRI中涉及的炎症应答靶点

除了梗死的冠状动脉机械性阻塞外，心肌梗死在很大程度上与动脉粥样硬化有关，因此缺血再灌注通常会触发局部无菌性炎症反应以及心肌细胞凋亡。然而，针对这一病理生理过程缺乏临床有效干预措施。某些促炎介质和细胞即使在同一心脏细胞群中也可能同时发挥有害作用和保护作用，因此相关途径的发现可能开发出更有用的治疗策略。此外，基于Toll样受体(toll-like receptors, TLR)在巨噬细胞激活时快速表达促炎因子(如TNFα和IL-6)的关键作用，功能缺失实验表明TLR5可能在MIRI时发挥重要的心脏保护作用。

在巨噬细胞介导的炎症反应中， Chemerin家族的内源性抗炎成分Chemerin15被认为是一种新型效应物，可通过减少心肌细胞凋亡，减少中性粒细胞浸润并诱导选择性M2型巨噬细胞极化来改善MIRI[23]。此外，使用脂多糖诱导的骨髓M2型巨噬细胞移植模型治疗MIRI小鼠的研究显示了相似的结果，表明A20(TNFα诱导蛋白3：TNFAIP3)可能通过限制代谢途径参与NF-κB信号传导的炎症反应，从而发挥心肌保护作用，但心肌细胞中A20激活的潜在机制尚需进一步研究[24]。

MIRI过程中急性炎症反应的另一个新成员是核苷酸结合寡聚域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)家族[25]，它在小鼠模型中通过JNK/p38MAPK/NF-κB 信号通路上调NOD2以加重MIRI[26]。相反，过表达负调节剂TIPE2产生的NOD2缺乏症可降低局部缺血/再灌注后促炎介质和心肌炎性细胞浸润[27]。这些研究表明，下调NOD2是一种潜在的治疗方法，而多水平靶向NOD2介导的TIPE2信号通路可能为MIRI和其他心血管疾病提供新的治疗策略。此外，这些研究(如表2所示)也帮助理解心血管系统中炎症网络相关的蛋白质的调节机制，以炎症反应特定成分为靶点的治疗方法具有一定前景。

表2 小鼠模型心脏和MIRI有关的炎症反应靶点

3.2 诱导MIRI的其他免疫反应底物

在早期炎症阶段过后，MIRI的病理生理变化会继而引起内源性信号，这些信号可能触发并进入以先天性免疫反应为主的抗炎阶段，其过渡阶段可能涉及心肌细胞与肝细胞成分之间免疫应答复杂的相互作用。细胞免疫反应和炎性微环境可在很大程度上引发MIRI患者的不良心脏重塑。研究人员和临床医生一直在尝试从先天性和适应性免疫系统的角度为AMI确定潜在的治疗性分子和细胞靶点。例如，通过体内外实验发现，几种免疫细胞对MIRI有积极的反应，包括周细胞、Ly6Chigh单核细胞、M2型巨噬细胞和CD8+/ AGTR2+T细胞[31]。

越来越多的证据支持调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocytes，Tregs)在对抗MIRI中的作用和潜在的治疗价值。Tregs通过激活Akt和ERK1/2途径来减弱心肌细胞凋亡，并通过下调中性粒细胞趋化因子和脂多糖诱导的CXC趋化因子生成LIX来减少中性粒细胞浸润和趋化因子的产生，从而维持MIRI心脏心肌细胞的活力，而其触发机制可能依赖CD39[32]。

由于免疫系统在MIRI期间可能同时发挥对心脏的保护和有害作用，因此对免疫系统的新靶点和治疗方法进行归纳(表3)，以保证MIRI时炎症与免疫应答的平衡。

表3 与MIRI相关的潜在免疫靶点

4 MIRI的遗传学和表观遗传学

4.1 与 MIRI相关显著的遗传位点

为了探索MIRI潜在关键分子靶点的潜在机制并进行相应治疗，必须确定它们在心肌组织中全基因组水平上的表达。 由于MIRI病理生理学的复杂性，特别是潜在序列变异的多样性以及可检测的表观遗传学修饰，这些修饰可能会改变不同的参与细胞群之间的基因表达谱[36]，因此可以认为基因组生物学，诸如高通量和高分辨率基因测序等技术能更精准地检测未知的治疗靶点，从而更好地了解与MIRI和心脏保护相关的信号网络。通过生物信息学进行的转录调控研究表明，肾脏酶(在MIRI期间升高的可代谢儿茶酚胺的酶)启动子上4个潜在的低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)结合基序是参与抗MIRI心脏保护的新型基因位点。 S100A1和S100A6[38]，含有EF-hand和Ca2+结合基序的S100家族蛋白成员，以及Annexin-5(含有Ca2+依赖性磷脂结合基序的Annexin家族成员[39])可能参与调节MIRI的几种内在凋亡途径，产生减小梗死面积并改善左心室收缩的功能。

4.2 MIRI的关键表观遗传调控因子

表观遗传学是指在不改变其DNA序列的情况下，对涉及组蛋白或非组蛋白的翻译后修饰(如甲基化/去甲基化和乙酰化/去乙酰化)、DNA甲基化和染色质结构进行细胞遗传修饰的研究，这被认为是响应快速和剧烈事件如心血管损伤或疾病的基因表达重要的机制。

由于MIRI是一种进行性发作损伤，其累积的病理生理表观遗传学改变可能会损害心脏功能，因此为了发掘新型治疗靶点，还应研究主导持续性心功能障碍的主要分子底物。在最近的一项关于MIRI表观遗传学的报道中，研究者对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖和严格保守的蛋白质脱乙酰酶家族SIRT1-7的作用进行深入研究[40]。研究表明，通过调控关键的表观遗传酶来改变基因表达谱可能对心肌梗死的研究和治疗以及心脏保护具有实际意义。然而，进一步探索组蛋白修饰和MIRI之间的因果关系以开发更多新的治疗靶点仍然是必要的。

5 总结与展望

尽管使用直接经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)或其他先进的治疗方法可将冠状动脉早期再灌注，但MIRI的临床发病率和病死率仍然很高，这是由于其病理生理因素的多维性和时空复杂性决定的。随着近十年生物医学研究的飞速发展，基因编辑技术和动物造模技术的进步，动态共聚焦显微镜成像、ChIPseq和大数据的生物信息学分析的优化，MIRI的潜在机制已经开始被揭示。从炎症免疫反应的调节和线粒体的能量和代谢到染色质的表观遗传修饰，越来越多的心脏保护分子靶点被发现。随着时间的推移，更多关于MIRI和心脏保护前沿研究有望成熟并应用于临床，使更多的AMI患者受益。但是在此之前必须提出更严格和创新的体内外实验方案，以解决与MIRI机制有关的科学问题。如前所述，来自基础实验研究的一系列新型分子靶点参与了MIRI各种生物过程的创新发现，并有望在全球范围内加大对这一领域研究，这种创新的发现令人鼓舞，但目前还没有有效的靶点或药物来治疗MIRI。关键的原因可能是MIRI通常是多因素的，并且在整个病理转化过程中会通过多种协同机制和多种细胞类型触发心肌细胞死亡。对于从基础到临床的研究，需要遵守最近为MIRI多靶点策略提出的临床前建议和指南，以便有效解决针对MIRI的心脏保护临床转化的问题。尽管如此，综述中总结的新发现可能有助于进一步发掘参与MIRI和心脏保护的新靶点。