嘴突凸脐蠕孢菌作为微生物除草剂的潜力研究

俞雯雯,袁炳钦,冯汝晴,郑镇桂,刘灵锐,陈勇

(华南农业大学农学院杂草研究实验室,广东 广州 510642)

杂草是农业生态系统中的重要植物资源,但它会与作物争夺水分、养料、光照、空间,降低农产品的品质,妨碍作物收获,影响粮食生产并造成经济损失。因此,防除杂草成为农业生产领域长期的研究课题。千金子[Leptochloachinensis(L.)Nees]是千金子属一年生禾本科杂草,广泛分布在各大水稻产区[1]。近年来,随着水稻轻型栽培技术的大面积推广和选择性除草剂的普遍应用,稻田杂草群落结构发生了巨大变化,千金子在南方稻区发生并迅速蔓延,己经成为仅次于稗草的恶性杂草,甚至在部分稻田的危害已经超过稗草,是中国水稻田最难防除的恶性杂草之一,严重抑制水稻的生长发育[2-5]。

目前,千金子防治主要依赖化学除草剂。然而化学农药的大量使用带来杂草抗药性、农药残留、环境污染等严重问题,直接威胁农业生产安全[6]。近年来具有选择性强、作物产生抗药性概率低、对人体和环境安全性高等优点的微生物除草剂逐渐受到国内外研究学者的重视[7-9]。微生物除草剂指利用植物病原微生物或其代谢产物来防治杂草的制剂[10],文献报道包括真菌和细菌在内有40多个属、80多个种的微生物具有防控杂草的能力[11]。在全球范围内,市场上现有13种源自微生物或天然分子的生物除草剂[12-13]。而用来防治千金子的微生物除草剂报道甚少。

本课题组研究发现嘴突凸脐蠕孢菌(Exserohilumrostratum)对千金子具有较强的致病性,对水稻以及其他多种作物安全[14]。本研究通过测定不同pH值、培养温度、光照、养分、碳氮源对菌株产孢量的影响,以及不同温度、pH值和常用农药对孢子萌发的影响,进而详细研究其生物学特性及其孢子悬浮液与常用农药混配后孢子萌发特性,为该菌株的大批量生产和应用到实际生产中提供相关数据,并为其作为制剂的开发、利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及供试菌株

嘴突凸脐蠕孢菌(Exserohilumrostratum)Y9511来自华南农业大学农学院杂草研究实验室,保藏编号为GDMCC No:60535。

8种农药为丙草胺[先正达(苏州)作物保护有限公司]、恶唑酰草胺(美国富美实公司)、氰氟草酯(安徽众邦生物工程有限公司)、莠灭净(广西易多收生物科技有限公司)、春雷霉素(华北制药集团爱诺限公司)、苯甲嘧菌酯(瑞士先正达作物保护有限公司)、多菌灵(安徽广信农化股份有限公司)、苯甲丙环唑(瑞士先正达作物保护有限公司),均由华南农业大学杂草研究实验室杨开强提供。

常规PDA培养基:40.1 g马铃薯葡萄糖琼脂,5～8 g琼脂粉,1 000 mL H2O,121 ℃高压灭菌30 min。完全培养基:100 g 蔗糖,0.5 g MgSO4·7H2O,3 g NH4NO3,0.1 g FeSO4·7H2O,2 g KH2PO4,17 g 琼脂,1 000 mL H2O,121 ℃高压灭菌30 min。缺少碳源、氮源、磷、硫、钾、铁、镁培养基的配制见表1。

1.2 影响菌株Y9511产孢量的因素

1.2.1 营养元素按表1配制不同的培养基,分别接种菌株Y9511进行产孢培养,每个处理6次重复。30 ℃恒温培养14 d后在显微镜下用血球计数板测定产孢量。

表1 不同营养成分培养基的配方Table 1 Formula of different nutrient media g

1.2.2 微量元素铜和锌在完全培养基(X1)中分别加入0.01%硫酸铜、硫酸锌配制供试培养基,接种菌株Y9511后培养,培养方法和产孢测定方法同1.2.1节。

1.2.3 碳源和氮源在去除碳源的完全培养基中分别加入100 g的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和α-乳糖配制出不同碳源的培养基,按1.2.1节的方法观察产孢量。

1.2.4 温度挑取适量菌株Y9511菌丝至PDA培养平板中央,分别置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40 ℃恒温培养箱中培养,每个处理6次重复。14 d后用血球计数板镜检产孢量[15]。

1.2.5 初始pH值用1 mol·L-1的NaOH和HCl调节以配制pH值分别为3.02、4.60、5.20、6.24、7.83、8.60、9.50的PDA培养基,后接种菌株Y9511进行培养,每个处理6次重复。30 ℃恒温培养14 d后用血球计数板镜检产孢量。

1.3 影响菌株Y9511孢子萌发的因素

1.3.1 温度菌株Y9511培养7 d后,用无菌水洗下孢子,4层纱布过滤去除菌丝体,稀释孢子悬液至每个视野约10个孢子备用,下同。取20 μL孢子悬液滴加在凹玻片的凹槽处,置于垫着湿润滤纸的培养皿内,在5、10、15、20、25、28、30、32、35、37、40 ℃恒温培养箱内培养24 h后,使用显微镜观察孢子的萌发情况。每个处理重复4次,每个重复观察100个孢子。孢子萌发率=孢子萌发数/观测孢子总数×100%。

1.3.2 初始pH值用1 mol·L-1的HCl和NaOH溶液调节备用的孢子悬浮液pH值,使孢子悬浮液pH值分别为3.02、4.60、5.20、6.24、7.83、8.60、9.50,在显微镜下观察孢子的萌发情况,方法同1.3.1节。

1.3.3农药按农药的田间推荐剂量(1×)、亚致死剂量(0.2×)、次亚致死剂量(0.1×)算出每个培养皿(直径90 mm)的使用量(保证每皿的有效成分不变)。按照表2用超纯水稀释配制不同基础浓度的农药,与适量备用的孢子悬液充分混匀,加入载玻片后,置于垫有滤纸的培养皿内,添加超纯水至水面刚好浸没载玻片,摇匀后在30 ℃培养箱培养24 h后镜检观察孢子萌发状况,以未加农药的培养皿作为空白对照,测定孢子萌发抑制率。每个处理重复3次。孢子萌发抑制率=(对照萌发率-药剂处理萌发率)/对照萌发率×100%[16]。

表2 农药稀释表Table 2 Herbicides dilution table

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0数据处理系统和Excel 2016进行统计分析,试验结果方差分析后进行Duncan’s多重比较检验各处理间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同营养成分对菌落生长的影响

从表3可见:与完全培养基(X1)相比,缺乏碳(X2)、磷(X4)、硫(X5)、钾(X6)、镁(X7)元素的培养基均显著抑制Y9511菌株的生长,培养3～7 d的菌落直径显著受到抑制。缺乏氮(X3)、铁(X8)元素处理下,菌株Y9511的生长快于完全培养基(X1),在整个培养过程中与其他处理差异显著。微量元素铜和锌对菌株Y9511的生长有显著抑制作用,加入微量元素铜和锌的培养基上菌株的菌落直径在培养3、4、5、6和7 d时低于完全培养基(X1)。

表3 不同营养成分对嘴突凸脐蠕孢菌菌株Y9511菌丝生长的影响Table 3 Effects of nutritional components on the growth of mycelium of Exserohilum rostratum strain Y9511

不同碳、氮源对Y9511菌落生长影响不同。在供试的5种碳源中,以可溶性淀粉为碳源时Y9511生长最快,与其他处理相比差异显著,其次是D(+)-蔗糖。以葡萄糖、麦芽糖和α-乳糖为碳源的培养基,Y9511生长较缺乏碳源培养基(X2)处理慢,且差异显著(图1)。加入供试的4种氮源后,与缺少氮源的培养基(X3)相比,菌株Y9511生长均受到抑制,且差异显著(图2),说明菌株无法利用这4种氮源,加入氮源会抑制菌株生长。

2.2 不同营养成分对产孢的影响

从表4可见:菌株Y9511在缺乏元素碳、氮、磷、镁、铁的培养基中的产孢量显著低于完全培养基(X1);与X1相比,缺钾和缺铜的培养基上菌株Y9511不产孢,说明钾和铜是菌株Y9511产孢必不可少的元素;缺硫和锌的培养基菌株Y9511产孢量显著高于X1,说明缺乏元素硫和锌的培养基更有助于产孢。

表4 不同营养成分对菌株Y9511产孢量的影响Table 4 Effect of different nutrients on the spore-producing of strain Y9511

菌株Y9511在供试的5种碳源培养基中均能产孢,与以蔗糖作为碳源的培养基相比,以葡萄糖、麦芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉为碳源菌株Y9511产孢量均显著降低,表明产孢最适碳源为蔗糖。在供试的 4种氮源培养基中,以(NH4)2SO4作为氮源菌株Y9511不能产孢,以Ca(NO3)2和大豆蛋白胨为氮源的培养基产孢量显著低于以NH4NO3为氮源的培养基,且以NH4NO3为氮源的培养基产孢量高于缺氮培养基,说明菌株Y9511产孢的最适氮源为NH4NO3。

2.3 温度和pH对产孢量的影响

由图3可见:菌株Y9511除在5 ℃外的其他温度下均可产孢,但低于15 ℃或高于35 ℃产孢量较小。在20～32 ℃,随温度升高产孢量显著增加,其中在32 ℃培养14 d产孢量最大,达8.15×106mL-1,与其他处理差异显著。

由图4可见:菌株Y9511在pH3～9条件下均能产孢。产孢量以pH值6.24时最高,达2.77×106mL-1,与其他处理相比差异显著;其次是pH值7.83和5.20。两者差异不显著;pH值为3.02和9.5时孢子数目最低,说明过酸或过碱均不利于该菌株的产孢。

2.4 温度、pH值以及农药混配对孢子萌发的影响

从图5可见:在5 ℃培养时菌株Y9511孢子不能萌发;10～30 ℃培养下,菌株Y9511孢子萌发率随温度升高而增加,30 ℃时孢子萌发率最高,为98.5%,与其他处理差异显著,之后随温度升高而下降。

菌株Y9511孢子在pH值3～9均能萌发,萌发率为50%～90%,其中pH值为6.24时,孢子萌发率最高,为85.8%,其次是pH7.83,为84.8%,两者差异不显著,但显著高于其他处理(图6)。表明该菌株Y9511孢子萌发最适pH值为6.24～7.83。

供试的8种农药对菌株Y9511孢子萌发均具有抑制作用,且因农药种类以及浓度的不同而呈现差异,抑制率为5.0%～89.4%(图7)。除了氰氟草酯和苯甲丙环唑3种处理浓度下的萌发抑制率无显著差异外,其他农药对孢子萌发抑制率均随浓度增加而增加,其中恶唑酰草胺、莠灭净、苯甲嘧菌酯的3种浓度间均有显著差异。常规浓度下,苯甲嘧菌酯的抑制率最高,达89.4%,与其他处理相比差异显著;其次是莠灭净,抑制率为81.1%;最低为氰氟草酯,抑制率为7.0%;其他农药抑制率为19.5%～42.1%。亚致死浓度下,抑制率最高同样是苯甲嘧菌酯,为61.8%,与其他组差异显著;抑制率最低是氰氟草酯,为5.0%。次亚致死浓度下,抑制率为5.8%～25.6%,其中恶唑酰草胺、苯甲嘧菌酯、苯甲丙环唑抑制率较高,三者间无显著差异。总之,菌株Y9511与供试农药氰氟草酯相容性最好,3种处理浓度下抑制率最高仅为7%;其次是多菌灵,3种浓度下抑制率为7.8%～19.5%;相容性最差的是苯甲嘧菌酯,其抑制率为25.1%～85.4%。

3 讨论

真菌除草制剂利用活的孢子和菌丝发挥其防治作用,但其应用经常受到各种非生物胁迫的影响,主要包括湿度、紫外线照射以及高温,所以具有良好生长特性的真菌菌株通常用于杂草的生物防治,且研究植物病原体生物学特性对于生物除草剂的开发具有重要意义[17-18]。

培养基是微生物发酵工业及微生物学研究的基础,目前常用培养基主要包括PDA、查氏、蛋白胨、清水琼脂、完全培养基等[19]。已报道的对草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌的生物学特性研究结果表明,其最适培养基为PDA培养基;枸杞根腐病的致病菌之一的单隔镰孢菌其最佳培养基为豆芽汁琼脂培养基[20-21]。本研究中,通过完全培养基缺素培养探究了多种元素对菌株生长的影响,研究结果表明,菌株Y9511生长需要碳、磷、硫等3种元素,Y9511菌株的生长受到氮、铁的抑制,微量元素铜和锌抑制Y9511菌株的生长;培养基添加元素碳、氮、磷、镁、铁促进产孢,钾和锌不可或缺,缺硫有助于产孢。

真菌会对各种碳、氮源进行选择性利用,且其利用碳、氮源的能力也因真菌种类差异而有所差别[19]。本试验中,在供试的5种碳源中,菌株对可溶性淀粉和D(+)-蔗糖的利用率较好,而对于葡萄糖、麦芽糖和α-乳糖的利用率较弱;以蔗糖为碳源的培养基产孢量最大,为1.47×106mL-1。在供试的4种氮源中,与缺少氮源的培养基相比,菌株生长均受到抑制,说明菌株无法利用这4种氮源,且加入氮源会抑制菌株生长;4种氮源中,NH4NO3为氮源的培养基产孢量最大,为1.47×106mL-1。

温度与细胞质膜的流动关联密切,影响酶促反应速率和真菌对营养物质的吸收以及代谢;pH值会影响真菌对营养物质的吸收以及酶促反应的效率,因此温度、pH值是影响真菌生长的重要因素[19]。本研究中,Y9511在低于15 ℃和高于35 ℃的条件下产孢受到抑制,32 ℃时产孢量达到最大值,为8.15×106mL-1;pH值在低于3.02和高于9.50时,产孢量较低,pH值为6.24时,产孢量达到最大值,为2.77×106mL-1;30 ℃时孢子萌发率最高,达98.5%;pH值为6.24时,孢子萌发率达到最大值,为85.8%。研究结果与陈勇等[22]对尖角突脐孢的生物学特性研究具有相似之处,如产孢适合温度相差不大,硝酸铵作为氮源产孢水平较好;但因为菌株的菌种不同也存在一定的差异,如菌株生长的最适pH值和碳源不同。菌株Y9511在田间利用最好避开夏季高温或冬季低温时节。然而,在实际应用中,对于嘴突凸脐孺孢菌控制千金子所需的温度、湿度、初始pH以及光照条件仍有待研究。

目前,千金子对多种除草剂产生交互抗性,针对化学除草剂使用面临的环境、食品安全等问题以及对杂草绿色防控技术的需求,研发新型生物除草剂已经成为杂草防控的研究重点。但现阶段农业生产上,生物除草剂的使用还是无法替代化学除草剂。研究发现,微生物除草剂与某些低剂量的化学除草剂复配使用能有效提高防除效果,且复配使用能够减少化学除草剂的相对使用量,从而在一定程度上降低化学除草剂对环境危害[23-25];复配使用能够有效扩大单一菌体的杀草谱,从一定程度上降低防除杂草的成本,以及改变菌体对寄主的专一选择性等多种作用[26]。因此,对于生物除草剂与化学除草剂混配使用的研究对除草剂开发具有重大意义。本文通过对嘴突凸脐蠕孢菌与不同化学农药混配的孢子萌发率评价了其与化学农药混配使用的可能性。通过与8种农药的混配,我们得出:供试农药中,氰氟草酯和莠灭净对该菌株孢子萌发影响较小,相容性最好,而苯甲嘧菌酯对孢子萌发影响最大,相容性最差。与农药混配时,最好选用对菌株孢子萌发抑制率较低的农药。

本研究对嘴突凸脐蠕孢菌菌株Y9511的生物学特性结果表明,将其作为生物除草剂进行大规模生产是可行的,且与化学农药混配的孢子萌发试验表明,其作为生物农药与化学农药混配使用是可行的,但对混配后的实际应用以及效果还需进一步探究。嘴突凸脐蠕孢菌作为微生物除草剂很有潜力,但对其致病机制以及具体侵染过程尚有待进一步研究。