香菇煮菇水木瓜蛋白酶酶解增鲜技术研究

李顺峰 刘丽娜 王安建 田广瑞 许方方

(河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是伞菌目口蘑科一种药食两用的真菌，因含有多糖、多酚、小分子肽以及膳食纤维等活性成分[1-3]而具有抗肿瘤、降血脂、提高免疫力等保健作用[4-6]，还含有丰富的5′-核苷酸和谷氨酸、天冬氨酸等呈鲜味氨基酸而呈现出鲜美的味道[7]。据中国食用菌协会统计[8]，2017年中国香菇产量为986.51万t，而河南省香菇产量为280.5万t，占全国香菇年产量的28.43%，位列全国第一。目前，香菇除了干制和鲜销以外，有将近30%的香菇用于加工，而在加工过程中烫漂是必需的工序，产生大量煮菇水(约800～1 400万t)，这些煮菇水含有大量水溶性营养成分等。如能将这些营养成分和呈味成分进行提取利用，制成保健食品、调味品等，不仅能提高企业的效益，还可以减少对环境的污染。

目前，对食用菌煮菇水的研究甚少，常树人[9]将煮平菇水用于制作平菇母种培养基，俞智明[10]利用煮菇水制备酱油。而对食用菌煮菇水的营养成分和呈味成分构成及其产品开发尚缺乏研究。另有不同温度处理对香菇香气成分变化方面的报道[11-12]，而对香菇煮菇水的利用研究鲜见报道。研究[13-14]表明，采用酶法得到的蛋白酶解液含有丰富的呈味氨基酸、呈味肽等呈味成分，已成为制备高档复合调味品的重要基料。试验拟以香菇煮菇水为研究对象，采用生物酶解技术提高其呈鲜味物质含量，增强风味，以期为香菇煮菇水的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

香菇煮菇水(干物质2.58 g/100 mL，其中蛋白质0.43 g/100 mL，总糖0.54 g/100 mL)：河南天中亿龙食品有限公司，经纱布过滤后备用。

1.1.2 试剂

5'-磷酸二酯酶：食品级，酶活1万U/g，南宁庞博生物工程有限公司；

磷酸二氢钾、四水合钼酸铵、高碘酸钠、乙酰丙酮、乙二醇、抗坏血酸、乙酸钠、乙酸等：国产分析纯；

5'-腺苷酸(5'-AMP)、5'-鸟苷酸(5'-GMP)、5'-肌苷酸(5'-IMP)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

5'-黄苷酸(5'-XMP)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

试验用水为蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备

分析天平：FA2004C型，上海越平科学仪器有限公司；

恒温振荡器：THZ-98AB型，上海一恒科学仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，岛津仪器(苏州)有限公司；

旋转蒸发仪：RV8V-C型，德国IKA集团；

恒温磁力搅拌器：DF-101S型，巩义市予华仪器有限公司；

艾柯超纯水机：Exceed-Bc-16型，成都康宁实验专用纯水设备厂；

台式高速冷冻离心机：H2050R型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

高效液相色谱仪：Ultimate 3000型，美国戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸态氮的定量测定 采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》第二法比色法。精密吸取0.1 mg/mL氨氮标准使用溶液0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL(相当于NH3-N 0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 μg)分别于10 mL比色管中，向各比色管分别加入4 mL乙酸钠—乙酸缓冲液(pH 4.8)及4 mL显色剂(15 mL 37%甲醛与7.8 mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100 mL，剧烈振摇混匀)，用水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min，取出，水浴冷却至室温后，移入1 cm比色皿内，以0管为参比，于波长400 nm处测量吸光度，绘制标准曲线或计算线性回归方程，回归方程为：y=0.861 6x-0.01(R2=0.999 0)。

1.2.2 木瓜蛋白酶酶解单因素试验 香菇煮菇水浓缩至原体积的1/2，取100 mL于三角瓶中，在加酶量0.20%、酶解时间3 h、酶解温度50 ℃条件下，分别采用不同的pH (5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)进行酶解；在酶解时间3 h、pH 6.5、酶解温度50 ℃条件下，分别采用不同加酶量(0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%)进行酶解；在加酶量0.30%、pH 6.5、酶解温度50 ℃条件下分别酶解1，2，3，4，5 h；在加酶量0.30%、酶解时间4 h、pH 6.5条件下，采用不同温度(40，45，50，55，60 ℃)进行酶解，按照1.2.1方法将氨氮标准使用溶液替换为样品溶液进行氨基酸态氮含量的测定，考察木瓜蛋白酶不同酶解条件对香菇煮菇水中氨基酸态氮含量的影响。

1.2.3 木瓜蛋白酶酶解正交试验 在单因素试验的基础上，对加酶量、酶解时间、pH值和酶解温度4个因素分别选取3个水平，对酶解工艺进行优化。

1.2.4 呈鲜味氨基酸、呈鲜味核苷酸的测定

(1) 呈鲜氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)含量：按GB 5009.124—2016执行。

(2) 呈鲜味核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鸟苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黄苷一磷酸(5′-XMP)]含量：酶解前后香菇煮菇水经4 000 r/min离心10 min后，上清液过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析[1, 15]。

1.2.5 等效鲜味浓度(EUC)计算 EUC值常用来表征食品的鲜味程度[16]，具体指：在100 g的食物中，以谷氨酸钠(MSG)的量来表示呈鲜物质的总量，其值按式(1)计算：

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj)，

(1)

式中：

Y——EUC值，g MSG/100 mL；

ai——呈鲜氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的含量，g/100 mL；

aj——呈鲜核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鸟苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黄苷一磷酸(5′-XMP)]的含量，g/100 mL；

bi——呈鲜氨基酸相对MSG的鲜味程度值(谷氨酸为1，天冬氨酸为0.077)；

bj——呈味核苷酸相对5′-IMP的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)；

1 218——协同作用常数。

1.3 数据处理

所有试验重复3次，测定结果以平均值±标准差表示，数据分析与整理采用SPSS软件和Excel软件，采用Origin 9.6作图。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解单因素试验

2.1.1 pH值对氨基酸态氮含量的影响 由图1可知，在试验范围内，随着pH的升高，氨基酸态氮含量逐渐升高，在pH 6.5时，氨基酸态氮含量达到最大0.43 g/100 mL，随着pH的继续增大，氨基酸态氮含量呈逐渐下降的趋势。这一结果与李顺峰等[17]和郑炯等[18]的研究趋势一致。这可能是由于在较适的pH范围内，酶的活性比较高，酶的水解作用有很大增强；而偏离了较适pH作用范围，影响了底物的空间构象，从而影响了酶与底物的结合。故选择pH 6.5作为较适宜酶解pH。

图1 酶解pH对氨基酸态氮含量的影响

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量对氨基酸态氮含量的影响 由图2可知，当加酶量由0.05%增加到0.30%时，氨基酸态氮含量由0.41 g/100 mL显著升高至0.50 g/100 mL，然后再继续增加加酶量，氨基酸态氮含量呈缓慢升高趋势，与加酶量为0.30%时相比，氨基酸态氮含量均未达到显著水平(P>0.05)，当加酶量增至0.40%时，氨基酸态氮含量仅比加酶量为0.30%时增加了0.002 g/100 mL，考虑后续工作和节约资源等综合因素，选择加酶量0.30%较为合适。

图2 加酶量对氨基酸态氮含量的影响

2.1.3 酶解时间对氨基酸态氮含量的影响 由图3可知，酶解时间在1～4 h，随着酶解时间的增加氨基酸态氮含量逐渐升高，酶解时间在4 h时，氨基酸态氮含量达到最大，随着酶解时间的延长，氨基酸态氮含量不再增加。这是由于随着酶解时间的延长，酶与底物充分接触，反应速度加快，促进了酶解反应的发生，使氨基酸态氮含量持续增加；当催化反应速度达到最大时，继续延长酶解时间并不能促进酶解反应的发生，故氨基酸态氮含量不再增加[19-22]。因此酶解时间确定为4 h。

图3 酶解时间对氨基酸态氮含量的影响

2.1.4 酶解温度对氨基酸态氮含量的影响 由图4可知，随着酶解温度的升高，氨基酸态氮含量逐渐升高，并在酶解温度为50 ℃时，氨基酸态氮含量达到较高水平(0.51 g/100 mL)，随后继续升高温度，氨基酸态氮含量则逐渐降低。这一趋势与Pan等[19]报道的采用纤维素酶提取大蒜多糖的趋势相一致。这可能是由于酶在较适的温度下有较高的酶活，催化反应速度快；而偏离(低于或高于)较适作用温度后酶的活性受到部分抑制或变性而失去活性[19-22]。因此酶解温度确定为50 ℃。

图4 酶解温度对氨基酸态氮含量的影响

2.2 木瓜蛋白酶酶解工艺正交试验优化

以氨基酸态氮含量为指标，对香菇煮菇水中氨基酸态氮的木瓜蛋白酶酶解工艺进行优化。正交试验水平设计见表1，试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素与水平表

表2 正交试验设计及结果

由表2可知，各因素对氨基酸态氮含量影响大小依次为C>A>D>B，木瓜蛋白酶酶解提高煮菇水中氨基酸态氮含量的最佳工艺组合为A1B3C3D3，即酶解 pH 6.0、酶解温度55 ℃、加酶量0.40%、酶解时间5 h。此最优条件为表2中第3组试验，其氨基酸态氮含量为0.454 g/100 mL。这一结果高于课题组[17]采用中性蛋白酶酶解香菇柄提取液的氨基态氮含量(0.046 g/100 mL)，可能与溶液中所含蛋白质含量和蛋白酶酶解能力有关。

2.3 木瓜蛋白酶酶解对香菇煮菇水鲜味的影响

由表3可知，木瓜蛋白酶酶解可显著提高香菇煮菇水中呈鲜味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量(P<0.05)，而对呈鲜味核苷酸含量无显著影响(P>0.05)。

表3 酶解对香菇煮菇水鲜味成分的影响†g/100 mL

呈鲜味氨基酸与呈鲜味核苷酸存在协同效应，可以增加蘑菇的鲜味。Mau[23]将蘑菇中呈鲜成分的等效鲜味浓度(EUC)分为4级：一级>10.0 g MSG/g干物质，二级1.0～10.0 g MSG/g干物质，三级0.1～10.0 g MSG/g干物质，四级<0.1 g MSG/g干物质。按此标准，酶解前后香菇煮菇水的EUC均为二级(酶解前后EUC分别为5.47，7.34 g/g干物质)，但EUC从酶解前的27.371 g/100 mL显著升高至36.683 g/100 mL。此结果高于Chen等[24]报道的香菇菌盖的EUC(二级)为1.068～3.427 g/g，菌柄EUC(三级)为0.359～0.951 g/g和赵静等[25]报道的香菇菌汤、酶解液和复水原液的EUC值分别为0.119，0.305，0.212 g/g 的结果。

3 结论

采用木瓜蛋白酶对香菇煮菇水进行酶解增鲜，经单因素试验和正交优化试验，得到木瓜蛋白酶酶解提高香菇煮菇水氨基酸态氮的最佳工艺条件为pH 6.0、酶解温度55 ℃、加酶量0.40%、酶解时间5 h，氨基酸态氮含量为0.454 g/100 mL。香菇煮菇水经木瓜蛋白酶处理后可显著提高呈鲜味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量，且经酶解后等效鲜味浓度显著增强。酶解前后香菇煮菇水的等效鲜味浓度均为二级，仍需通过筛选不同酶、多酶协同作用等提高呈鲜味成分含量，进而增强鲜味。