Arhgap29 基因多态性与宁夏地区人群非综合征型唇腭裂的相关性

周子铃， 马 坚， 侯宇转， 于丽丽， 丁小艳， 韩 龙， 黄永清

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学口腔医院口腔外科，银川 750004）

唇腭裂（oral cleft or palate）是最常见的颅颌面畸形，全球范围内发病率为1/700[1]，我国以1.4/1000 的发病率成为世界高发国家之一[2]。在宁夏新生儿出生缺陷疾病中居于首位，发病率为1.85/1000[3]。该疾病不仅影响患儿的生长发育，降低患儿家庭生活质量，也影响了我国出生人口素质[4]。唇腭裂分为综合征型唇腭裂（SCL/P）和非综合征型唇腭裂（NSCL/P），非综合征型唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有其他系统器官畸形，不属于任何综合征范围之内的单纯唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的总称[5]。近年来研究筛选发现很多与NSCL/P 相关的易感基因，包括 1q32.2（IRF6）、20q12（MAFB）、8q24.21（MYC）、4p16.2（MSX1）、17p13.1（NTN1）、10q25.3（SHTN1、VAX1）、5p12（FGF10）等[6-9]。2010年Beaty 对亚洲及欧洲唇腭裂人群进行GWAS（genome-wide association studies）后提示 ABCA4和MAFB 在亚洲人群中更加显著的异常表达[10]。但ABCA4 在唇部和腭部不表达，而ABCA4 第一内含子中一段保守序列促进基因的显著表达会在小鼠面中部出现异常表征，这与Arhgap29 的RNA在人颅面部的表达模式类似[11]。Letra 等[12]于2014年在非西班牙裔白种人群中进行验证，发现Arhgap29 基因上 3 个位点（rs3789688、rs1541098、rs1576593）与NSCL/P 有强相关性。随后2017 年Paul 等人通过在小鼠基因组中插入从NSCL/P 患者中筛选到的点突变体，构建一个新的Arhgap29基因的无义突变（K326X）小鼠模型，该突变可能会导致基因功能缺失（LoF），使Arhgap29 基因沉默进而引起唇腭部发育期上皮连接异常[13]。

本课题组前期通过大家系样本测序，得知Arhgap29 是与NSCL/P 最具相关性的易感基因之一。因此，本研究选取Arhgap29 上23 个常见SNP位点进行人群验证，探讨在宁夏Arhgap29 基因多态性与非综合征型唇腭裂是否具有相关性。

1 对象及方法

1.1 研究对象

收集 2014 年 1 月—2018 年 12 月就诊于宁夏医科大学总医院口腔颌面外科的唇腭裂患者500 例（男孩 306 例，女孩 194 例）为病例组；本医院同期出生的正常新生儿450 例（男孩233 例，女孩217 例）为对照组。所有样本均严格按照纳入标准进行收集，病例组纳入标准：①患儿为先天性NSCL/P 且不伴有其他系统器官的先天性畸形及后天疾病；②患儿家庭无其他遗传病家族史；③患儿双亲精神正常，能接受问卷调查者；④患儿父母家庭至少三代为宁夏籍。对照组纳入标准：除符合新生儿无任何系统器官的先天疾病或畸形外还应满足病例组纳入标准中的②、③、④。本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（批号：2015-076），所有样本收集均征得患者或其监护人知情同意，并签属知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本DNA 提取 由经统一培训的实验人员采集病例组、对照组外周静脉血5 mL，加EDTA 抗凝剂，使用Wizard 基因组DNA 纯化试剂盒来提取纯化基因组DNA，再对所提取的样本DNA 分别经紫外线吸收法和琼脂糖凝胶电泳法测定浓度及纯度，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因分型 结合Hapmap 基因库、haploview中的tagSNP 及MAF＜0.5 作为选取标准，选取Arhgap29 基因上23 个常见的SNP，于Ion Torrent测序平台上对所选SNP 运用AgriSeqTM 靶向测序技术进行基因分型。该方法是在待测DNA 自动构建AgriSeqTM 文库后，通过油包水PCR 扩增多个SNP 靶标以构建稳定的测序模板，再经过纯化后进行测序和基因分型。从而达到鉴定不同基因型的目的。此部分实验委托博奥生物公司完成（通过对生物公司经过多方考察和对比，公司后期给予质控标准及验证，可保证数据可靠）。

1.2.3 实验耗材 实验选用东盛生物科技有限公司生产的5mL EDTA 抗凝采血管（K2）、美国贝克曼库尔特有限公司的台式高速离心机（GS-15R）、德国 Eppendorf 公司的小型高速离心机（5424R），电热恒温水浴箱（上海电子仪器厂（DK-8B））、NanoDrop2000 微量紫外分光光度计（美国 Equl-Thermo SCIENTIFIC（ND2000））、美国普洛麦格 Promega 公司的Wizard 基因组 DNA纯化试剂盒（A1120）等仪器和试剂用于提取DNA。

1.3 统计学方法

对照组基因分型结果进行H-W 平衡分析；采用SPSS 17.0 软件对病例组和对照组中基因位点的等位基因及基因型频率进行χ2检验，检验水准α=0.05；运用Haploview 软件对这些SNP 位点进行连锁分析和单倍型分析。

2 结果

2.1 H-W 平衡检验

Arhgap29 基因常见的23 个SNP 位点基因型频率经H-W 平衡检验无统计学意义（P＞0.05），符合 H-W 平衡（表 1）。

2.2 病例组和对照组Arhgap29 基因中 23 个SNP 位点等位基因及基因型分析

23 个SNP 差异位点中的4 个位点rs3814019（等位基因=7.763，P=0.0053；基因型=7.907，P=0.019）、rs7540684（等位基因=6.243，P=0.0125；基因型 6.403，P=0.041）、rs17396055（等位基因=4.249，P=0.0393；基因型=7.631，P=0.022）和rs72964308（等位基因=4.74，P=0.0295；基因型=7.907，P=0.019）的基因型和等位基因频率在病例组与对照组间差异均有统计学意义（P 均<0.05）（表 2）。

表2 Arhgap29 基因中23 个SNP 位点等位基因及基因型分析

2.3 连锁不平衡及单倍型分析

连锁分析显示，23 个SNP 位点形成2 个连锁block（单体型块 1：rs1411700、rs1411701、rs12044 374、rs11196、rs17111203、rs17111206、rs11577575、rs1411702、rs3789691、rs77940435、rs2274788。单体型块2：rs7554714、rs6541343、rs1999270、rs3814019、rs72964308、rs17111259、rs1756245、rs17396055、rs7540684、rs1360365、rs6697764、rs1756248），2 个block 共有4 个单倍型组合在病例组和对照组之间差异均有统计学意义（P 均<0.05）。block 1：单倍型CGCAAGGGCGC（P=0.0406）和单倍型AATCGG GGCGT（P=0.0479）。block 2：CGTGCTCGGAGG（P=0.0103）单倍型和 CGTATTCAAAGG（P=0.0336）单倍型（表 3、图 1）。

3 讨论

非综合征型唇腭裂的病因复杂，病因涉及遗传基因和环境因素以及两者的交互作用[7]。在非综合征型唇腭裂的多基因阈值假说中，数个中效或轻度微效基因会共同作用，微弱作用叠加达到一定的阈值从而导致NSCL/P 的发生，这属于数量性状遗传[5]。随着现代分子生物学技术的不断发展，国内外对NSCL/P 易感基因定位筛选不断更新。从遗传标记分子检测，过渡到以基因芯片为主要手段的全基因组关联研究，到目前主要以二代测序为基础的全基因组或及外显子组为代表的基因组学研究，这些都为探究NSCL/P 易感基因及发病机制提供了非常重要的线索。

Arhgap29 基因位于染色体1p 22.1 区域，含有24 个外显子，在上皮细胞中表达较高，尤其是在口腔、舌、腭上皮中强表达。该基因距ABCA4基因 47kb，编码 Rho-GTP 酶活化蛋白 29[14]。Arhgap29 可使 RhoA 由 GTP 限制型变为 GDP 限制型进而失活，从而影响下游效应分子ROCK，调节细胞动力学和肌动蛋白细胞骨架，使细胞的分裂、周期异常、上皮细胞极性的稳定性发生改变，并参与EMT 过程的调控[15-17]。针对此基因与NSCL/P 的研究发现，Arhgap29 可能在 IRF6 的下游发挥作用，在IRF6 基因表达缺失的小鼠腭上皮和皮肤中Arhgap29 基因表达被抑制[18-19]。Leslie等[20]对唇腭裂病因学的研究也进行了小鼠模型试验，结果证实 Arhgap29 与 WNT、IRF6、TGFB等信号通路有关联。而这些信号通路在众多研究中被证实与 NSCL/P 的发病具有强相关性[18，20-22]。因此可以推测Arhgap29 是NSCL/P 一个十分重要的候选基因。

表3 Arhgap29 基因中23 个SNP 位点单倍型分析

国内尚未有关于Arhgap29 基因与唇腭裂相关性的研究，本研究针对Arhgap29 基因中23 个常见的SNP 进行了单点分析和多点的相关性分析。H-W 平衡检验显示，对照组的基因型分布符合H-W 平衡，所收集的样本具有很好的群体代表性。rs3814019、rs72964308、rs7540684 和 rs17396055这4 个位点的等位基因型和基因型频率在病例组与对照组间差异有统计学意义，虽然与Letra[12]等学者于2014 年在非西班牙裔唇腭裂白种人群中发现的Arhgap29 基因上的三个易感位点（rs3789688、rs1541098、rs1576593）并不一致，但不同人群中导致唇腭裂的位点并不相同是有可能的，这也与NSCL/P 病因学中的基因和环境因素协同影响才会形成唇腭裂的理论不违背，所以不同位点的确认更加确认Arhgap29 基因与唇腭裂存在相关性；基于唇腭裂疾病是多因素疾病，在我们进行的多位点的连锁分析中显示，23 个SNP位点形成2 个连锁block 中共有4 个单倍型组合在病例组和对照组间差异有统计学意义。每个block 中各有2 个单倍型组合，分别为block1 中的单倍型CGCAAGGGCGC（单倍型频率=0.278，P=0.0406）、单倍型 AATCGGGGCGT（单倍型频率=0.097，P=0.0479）和 block2 中的单倍型CGTGCTCGGAGG（单倍型频率=0.456，P=0.0103）、单倍型 CGTATTCAAAGG（单倍型频率=0.105，P=0.0336）。病例对照研究中四个有意义的位点均位于block2 中，提示block2 是Arhgap29 基因中很有价值的研究区域。这为我们后期进行Arhgap29 基因与NSCL/P 发病机制之间的功能验证奠定了基础。以上结果和Arhgap29 基因与众多易感基因的相关性均提示Arhgap29 基因多态性与NSCL/P 之间存在某种关联。

综上，Arhgap29 单核苷酸多态性变异与宁夏地区NSCL/P 人群的发病有相关性。这一研究结果为我们后期进行Arhgap29 基因与NSCL/P 发病机制之间的功能验证奠定了基础。