髓样锌指1 对宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用

牛永莉， 贾晓波， 王 艳

（1.甘肃酒泉市人民医院医学辅助生殖专科，酒泉 735000； 2.甘肃酒泉市人民医院妇产科，酒泉 735000）

宫颈癌是最常见的五大妇科肿瘤之一，每年全世界宫颈癌的发病人数约为50 万[1]。研究[2]发现，人类乳头瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈癌的重要原因，基因变化导致基因组的不稳定则是宫颈癌发生的重要机制。有研究[3]表明，宫颈癌细胞染色体变化是非随机的，而宫颈癌细胞染色体频繁杂合性缺失，抑癌基因可能与宫颈癌的发生发展密切相关。肿瘤的转移主要包括细胞迁移、侵袭、黏附以及细胞外基质（ECM）蛋白的降解，且与 MMP-2 和 MMP-9 高表达相关[4-5]。此外，宫颈癌上皮内瘤病变（CIN）程度增加，MMP-2 表达也逐渐增加，这一现象表明MMP-2 过度表达可能引起潜在的肿瘤入侵和转移[6]。髓样锌指1（MZF1）基因是C2H2型锌指转录因子Kruppe 家族的一员[7]，MZF1 参与造血和非造血细胞的分化、迁移和增殖[8]，抑制MZF1 表达则能够抑制人肝细胞癌增殖、迁移和入侵[9]。然而，在高侵袭性的宫颈癌细胞中，MZF1 是如何调节MMP-2 表达的分子机制尚不是十分清楚。我们将考察MZF1 抑制人类宫颈癌细胞的迁移和侵袭的作用机制，并探究MZF1 如何影响MMP-2 表达。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系、质粒 人子宫颈鳞癌细胞SiHa购于美国ATCC 细胞库，本课题组前期已成功构建过表达质粒（pcDNA-MZF1），并通过测序验证。

1.1.2 试剂 MZF1 抗体、MMP-2 抗体、MMP-9抗体以及β-actin 抗体（美国Santa Cruz 公司）；Jet-PEI 转染试剂（法国 PolyPlus 公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RT-PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；实验所需引物由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成，实验所用其他试剂购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和稳定转染 将人子宫颈鳞癌细胞SiHa 细胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的细胞培养基（DMEM）中，在CO2体积分数为5%、温度为 37 ℃的饱和湿度孵育箱中培养；待细胞处于对数生长期时，将 SiHa 细胞［（1～5）×105］接种于 100 mm的培养皿中，细胞铺满培养皿的70%时，用Jet-PEI试剂，将pcDNA-MZF1（MZF1）转染培养的SiHa细胞，同时转染pcDNA3.0（Neo）作为对照。转染后48 h，过度表达Neo 或MZF1 的SiHa 细胞以1∶10 的分流比传代，经 G418（800 μg·mL-1）筛选抗性克隆，通过RT-PCR 检测目的基因mRNA表达量，Western blot 分析检测目的基因表达产物，得到稳定转染的细胞系。

1.2.2 RT-PCR 实验 利用Trizol 提取法从Neo或MZF1 高表达的SiHa 细胞中分离总RNA。根据宝生物工程（大连）有限公司的反转录试剂盒合成cDNA，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。MZF1 引物 For：5’-AGGTCCAGGTAGTGTAAGCCCT-3’，Rev：5’- ACTCTCCGATGCTCTTCCAG-3’。内参 β-actin 作为对照，引物序列 For：5’-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC -3’，Rev：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3’。通过 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 产物，EB 染色后，用Quantity One 软件检测条带的灰度值，以目的基因与内参的比值作为MZF1 基因mRNA 的相对表达量。

1.2.3 Western blot 实验 提取过度表达Neo 或MZF1 的SiHa 细胞蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，取含等量蛋白质（30 μg）的提取物进行SDSPAGE 电泳，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移到 PVDF 膜（Millipore，美国），5%脱脂奶粉封闭，加入稀释后的一抗，4°C 孵育过夜，TBST 漂洗3 次，HRP 标记的二抗室温孵育2 h，经ECL 显色，在暗室内曝光，显影。用Quantity One 软件分析目的条带的灰度值，比较蛋白的相对表达量。

1.2.4 细胞活性分析 通过MTT 实验检测Neo或MZF1 高表达的SiHa 细胞活性。将状态良好的SiHa 细胞用胰酶消化后，轻轻吹打成单细胞悬液，以8000 个/孔接种于96 孔板中，放入CO2培养箱中培养24 或48 h。各孔加入10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），孵育 4 h，弃去上清，加入 150 μL DMSO，置于摇床上摇动混匀20 min，在490 nm处检测各孔的吸光度值。

1.2.5 细胞周期检测 将高表达Neo 或MZF1的SiHa 细胞用不含EDTA 的胰酶消化后，低速离心，去上清收集细胞，4 °C 预冷的PBS 洗涤2次，加入70% 冰乙醇，在4 ℃冰箱固定过夜。固定后的细胞再经PBS 洗涤2 次，加入500 μL 含50 μg·mL-1碘化丙啶（PI），100 μg·mL-1RNase A，0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液重悬细胞，避光孵育30 min。通过FACSCalibur 流式细胞仪分析细胞周期分布情况。

1.2.6 MMPs 活性检测的明胶酶谱法 从Neo或MZF1 高表达的SiHa 细胞中提取的蛋白用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶（含有0.1%明胶）分离。电泳结束后，将凝胶置于含2.5% Triton X-100 的洗脱液中震荡洗涤2 次，每次45 min，接着用漂洗液（除不含Triton X-100，其余同洗脱液）漂洗2 次，每次20 min，然后在缓冲溶液［（pH 8.8 50 mM Tris-HCl、5 mM CaCl2和 0.02%（w/v）NaN3］中于37°C 孵育42 h。孵育结束后，用染色溶液（0.1%考马斯亮蓝、30%甲醇、10%乙酸）将凝胶染色1 h，脱色液（30%甲醇、10%乙酸）脱色，在暗色背景下可观察到MMP-2 和MMP-9 清晰的染色条带。通过凝胶经成像系统记录后，使用Quantity One 软件进行灰度值分析，比较MMPs 的表达差异。

1.2.7 细胞的迁移和侵袭检测 将8 μm 孔径的聚碳酸酯膜置于Boyden 小室的上下室之间。下室充满含20% FBS 的DMEM 培养基。取处于对数生长期SiHa 细胞，消化离心，以无血清DMEM培养基重悬细胞，加入Boyden 小室的上部，在培养箱中培养24 h。培养结束后，用棉签将上室内未穿过微孔膜的细胞轻轻擦掉，甲醇固定10 min，并用 0.05% Giemsa 染色 30 min，PBS 缓冲液清冼至无残留物，并吹干，在200 倍镜下，观察迁移到下室的细胞数量，随机取5 个视野计数，取平均值，记录数据，分析细胞的迁移能力。细胞侵袭检测实验前先将Matrigel 基质胶4 ℃过夜融解，在冰上用无血清DMEM 培养基稀释成1 mg·mL-1的混悬液，在加入细胞悬液前，聚碳酸酯微孔膜表面铺上100 μL 的Matrigel 基质胶混合液，其余实验过程与迁移检测方法一致，通过计数穿膜细胞数来反映细胞的侵袭能力，即显微镜下对迁移和侵袭的细胞进行观察并拍照，随机选取5 个视野，技术一定面积下结晶紫染色的细胞，将单个视野下技术细胞的平均值除以单个视野的面积，再乘以transwell 小室的总生长面积，即得到迁移或侵袭的总细胞数。用迁移或侵袭的总细胞数除以接种的初始细胞数，即得到迁移率和侵袭率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件对数据进行分析。所有实验均独立重复3 次，数据均以均数±标准差（）表示。P≤0.05 为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 高表达的Neo 或MZF1 与SiHa 细胞增殖无关

培养转染Neo（pcDNA）或 MZF1 表达载体（pcDNA-MZF1）的SiHa 宫颈癌细胞，选择一个在蛋白水平（图1A）和mRNA 水平（图1 B）稳定高表达MZF1 的单克隆细胞系。以MTT 实验检测高表达MZF1 对 SiHa 细胞生长活性的影响，实验数据表明，MZF1 的过度表达并不影响SiHa 细胞的生存能力（图2A）。通过流式细胞术分析稳定转染细胞的周期分布，确定MZF1 高表达是否影响SiHa 细胞增殖，结果证明，高表达的Neo 或MZF1 并不影响SiHa 细胞增殖（图2B）。

2.2 MZF1 过表达抑制SiHa 细胞的侵袭

通过细胞迁移和侵袭实验研究MZF1 在癌细胞转移过程中发挥的作用。实验结果表明，pcDNA-MZF1（MZF1）细胞株比 pcDNA（Neo）细胞运动减少了70%（P<0.05）。由此可见，MZF1 过度表达减弱了 SiHa 细胞的迁移能力（图3A）。在侵袭实验中，过度表达MZF1 的SiHa 细胞穿过Matrigel 基质胶的细胞数量明显减少了80%（图3B）。说明过度表达MZF1 减少人子宫颈鳞癌SiHa 细胞的侵袭性。

2.3 稳定转染 Neo 或 MZF1 的 SiHa 细胞 MMP-2 蛋白和 mRNA 水平及 MMP-2 和 MMP-9 活性

Western blot 结果表明：在过度表达MZF1 的SiHa 细胞中，MMP-2 的蛋白表达明显减少（图4A）。RT-PCR 分析结果表明：高表达的MZF1 同样抑制了MMP-2 的mRNA 水平（图4B）。此外，通过明胶酶谱法检测了MMP-2 和MMP-9 的活性，转染细胞中高度表达的MZF1 只抑制MMP-2 的活性，并没有对MMP-9 的活性产生影响（图4C）。综上所述，过度表达的MZF1 抑制了MMP-2 的表达，但却不影响MMP-9 的活性。

3 讨论

尽管MZF1 与肿瘤细胞迁移和侵袭密切相关，但在人类宫颈癌发展过程的作用机制尚未阐明。因此研究MZF1 在宫颈癌中的生物特征、生物学功能和分子作用机制具有重要意义。在这项研究中，通过建立MZF1 稳定过度表达的SiHa细胞系，发现高表达MZF1 抑制了MMP-2 的表达和活性，说明MZF1 对宫颈癌细胞的转移发挥着重要作用。

已有研究[10]表明，在乳腺癌细胞中，ErbB2 诱导组织蛋白酶B 表达，增加癌细胞的侵袭能力，这一现象关键在于ErbB2 激活MZF1，MZF1 结合到ErbB2 的增强子原件——组织蛋白酶B 的第一内含子，从而使组织蛋白酶B 激活，并通过ErbB2 下游的 PAK4、Cdc42bpβ、PKCα、ERK 等激酶发挥作用，促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭过程。研究[11]发现，高度表达的MZF1 抑制细胞凋亡，促进肿瘤的形成，并反式激活Axl 启动子，引起基因表达，诱发实体瘤细胞迁移、侵袭和转移的潜力。应用MZF1 基因敲除技术，发现其在体外可抑制肝癌细胞生长，在体内可抑制肝细胞肿瘤形成。因此，MZF1 被认为是潜在的致癌基因，影响癌症发生和发展。在裸鼠移植瘤模型中，缺乏MZF1 的裸鼠发生肿瘤的概率增加，说明MZF1可能抑制肿瘤发生[7]。研究[12]发现，MZF1 在宫颈癌和结肠癌中具有双向转录调控作用，过表达MZF1 可通过结合Axl 基因启动子抑制肿瘤细胞侵袭和转移。

癌细胞转移是一个复杂的过程，涉及侵袭、内渗、扩散、附属组织增长等阶段。肿瘤侵入细胞外基质是关键的一步，侵袭使肿瘤细胞具有降解细胞外基质的能力。蛋白水解酶MMP-2、MMP-9直接参与肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。在众多肿瘤中，如宫颈癌，已经发现高表达MMP-2 与预后因素相关[13]。通过Western blot 以及RT-PCR实验，我们对过度表达MZF1 细胞的MMP-2 水平进行了检测：MZF1 高表达明显下调了SiHa 细胞内源性MMP-2 的蛋白表达和mRNA 水平。明胶酶谱法结果表明细胞内MZF1 过度表达抑制了MMP-2 活性。虽然MMP-9 对宫颈癌细胞的侵袭也起着重要作用，但令人惊讶的是，在稳定转染Neo 或 MZF1 细胞中，MMP-9 表达水平及活性保持不变。由此可见，MZF1 可能通过抑制MMP-2 表达活性，减弱SiHa 细胞迁移和侵袭的能力。

总之，本研究证明了过度表达的MZF1 抑制了MMP-2 的活性及基因表达，导致人类宫颈癌细胞的迁移和侵袭受到抑制，下一步工作我们将深入研究在宫颈癌细胞中MZF1 通过何种信号传导通路调节MMP-2 基因表达。